Entwirren Key Player der humoralen Immunität: erweiterte und optimierte Lymphozyten isoliert Protokoll von Murine Peyer Patches
Summary
In dieser Studie präsentieren wir eine neue und effektive Protokoll für die Isolierung von Lymphozyten aus Peyer Patches (PPs), die anschließend für in Vivo und in Vitro funktionelle Assays sowie Flow durchflusszytometrischen Studien des follikulären T verwendet werden können Helfer und germinal Center B-Zellen.
Abstract
In der Darm-Schleimhaut bilden Immunzellen eine einzigartige immunologische Einheit, die Immuntoleranz fördert, während die Übertragung gleichzeitig Immunabwehr gegen Krankheitserreger. Es ist allgemein bekannt, dass Peyer Patches (PPs) eine wesentliche Rolle in der Schleimhaut immun-Netzwerk haben, durch die Veranstaltung von mehreren Effektor T und B-Zell-Subsets. Ein bestimmten Anteil dieser Effektorzellen, follikuläre T Helfer (TFH) und germinal Center (GC) B-Zellen sind in der Verordnung der humoralen Immunität professionalisiert. Daher bieten die Charakterisierung dieser Zelle Teilmengen innerhalb von PPs in Bezug auf ihre Differenzierung-Programm und funktionellen Eigenschaften wichtige Informationen über die Schleimhaut Immunität. Zu diesem Zweck wäre eine leicht anwendbare, effiziente und reproduzierbare Methode der Lymphozyten isoliert von PPs wertvoll für Forscher. In dieser Studie hatten wir vor, eine wirksame Methode zur Isolierung von Lymphozyten aus Maus PPs mit hohe Zellausbeute zu generieren. Unser Ansatz offenbart, dass anfängliche Gewebe wie die Verwendung von Verdauungs Reagenzien und Gewebe Agitation, Verarbeitung sowie Zelle Färbung Bedingungen und Auswahl von Antikörper-Panels, haben großen Einfluss auf die Qualität und Identität der isolierten Lymphozyten und auf experimentelle Ergebnisse.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, Forscher, um effizient Lymphozyten-Populationen von PPs ermöglicht reproduzierbare Flow Cytometry Beurteilung der T- und B-Zelle Teilmengen Schwerpunkt auf TFH und GC B Zelle Teilmengen zu isolieren.
Introduction
Der gesamte Magen-Darmtrakt von Anfang bis zum Ende ist mit einem umfangreichen lymphatischen Netz geschmückt, die Immunzellen mehr als jedes andere Organ in der Human- und Maus1enthält. Peyer ist Patches (PPs) bilden einen wesentlichen Bestandteil der intestinalen Zweig dieser zellulären immun-Organisation, so genannten Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT)2,3. In PPs, Tausende von Millionen von Antigenen abgeleitet aus diätetischen Materialien Kommensale Mikrobiota und Krankheitserreger sind ständig abgetastet wird und wenn notwendig entsprechende Immunantworten gegen sie sind montiert so Pflege Darm immun Homöostase. In diesem Sinne könnte PPs als “Mandeln des Dünndarms” benannt werden. KKS bestehen aus großen Sub Fächer: subepithelialen Kuppel (SED), große B-Zell-Follikel-Zonen; die darüber liegende Follikel-assoziierten Epithel (FAE) und interfollikulären Region (IFR), wo T-Zellen befindet sich4sind. Dieses einzigartige Abschottung der PPs ermöglicht verschiedenen Effektor Zelle Teilmengen zu kooperieren und verleiht somit Immunkompetenz im Darm.
PPs fehlt afferenten Lymphgefäße, und aus diesem Grund werden Antigene zu PPs aus Dünndarm transportiert nicht durch Lymphgefäße im Gegensatz zu die meisten von den anderen lymphatischen Organen durchgeführt. Stattdessen sind spezialisierte Epithelzellen befindet sich in FAE, so genannte M-Zellen, verantwortlich für die Übertragung der luminalen Antigene in der PPs-5. Anschließend werden die transportierten Antigene von dendritischen Zellen (DCs) abgeholt und Fresszellen, die im Großraum subepithelialen Kuppel (SED) unter die FAE6,7befinden. Dieses Antigen Sortierverfahren von DCs in der PP ist entscheidend für die adaptive Immunantwort8 und nachfolgende Generation von IgA insulinproduzierenden Zellen9zu initiieren.
Aufgrund der schweren Antigenen Belastung von Kommensalen Flora und diätetische Material aktiviert PPs Host endogen Effektor T und B Zelle Teilmengen in großen Häufigkeiten wie TFH und IgA+ GC B Zellen10, was darauf hindeutet, dass PPs eine Website des aktiven Immunsystems darstellen Antwort11. Erkennung von bis zu 20 – 25 % TFH Zellen im gesamten CD4+ T Handy-Fach und bis zu 10 – 15 % GC B innerhalb der gesamten B-Zellen Zellen ist möglich in KKS geimpfte junge C57BL/6 Mäusen12abgeholt. Im Gegensatz zu anderen T-Helfer-Zelltypen (i.e., Th1, Th2, Th17-Zellen), TFH Zellen zeigen einzigartige Tropismus in B-Zell-Follikel vor allem wegen CXCR5 Ausdruck, der TFH Zelle Homing entlang CXCL13 gradient13fördert. In den B-Zell-Follikel Zonen der PPs induzieren TFH Zellen IgA Class Switch Rekombination und somatische Hypermutation in aktivierten B-Zellen hohe Affinität IgA produzieren Zellen14 unterscheiden. Anschließend diese Antikörper-sezernierenden Plasmazellen migrieren in der Lamina Propria (LP) und immun Homöostase in den Darm10zu regulieren.
Identifizierung und Charakterisierung der TFH und GC B-Zell-Populationen in PPs könnten Forscher zu untersuchen, die Dynamik der humoralen Immunantwort unter Steady-State-Bedingungen ohne zeitraubende Immunisierung Modelle ermöglichen. traditionell verwendet im TFH-GC B Zelle Studien15,16,17,18. Analyse der TFH Zellen innerhalb von PPs ist nicht so einfach wie andere Zelle Teilmengen. Technische Herausforderungen sind ideale Vorbereitung Gewebeverhältnisse, Oberfläche Antikörper-Marker Kombination Identifizierung sowie die Auswahl geeigneter positiver und negativer Kontrollen. TFH und PP Forschungsfelder weisen große Variabilität in Bezug auf die experimentelle Verfahren und sind bei weitem nicht die Übertragung eines Konsens um standardisierte Protokolle aus mehreren Gründen zu etablieren. Erstens neigt jede Zelle Teilmenge innerhalb PPs differentiell Gewebeverhältnisse Vorbereitung erfordern weitere Änderungen in einer Zelle Teilmenge-spezifische Art und Weise betroffen zu sein. Zweitens gibt es eine deutliche Diskrepanz zwischen den gemeldeten Methoden über die Details der Zelle Vorbereitung von Dritten PPS, die Anzahl der Protokoll-basierte vergleichende Studien untersuchen ideale Gewebe Präparationstechniken und experimentellen Bedingungen für PP und TFH ist Forschung eher begrenzt.
Aktuelle Protokollbasierte Studien vorgeschlagen für PP Zelle Vorbereitung19,20,21,22 waren nicht TFH oder GC B-Zell-orientierte. Darüber hinaus einige Gewebe Herstellungsbedingungen für PPs19,20 wie Kollagenase-basierte Verdauung empfohlen wurden gefunden, um negativ auf das Ergebnis der TFH Identifikation durch Durchflusszytometrie18. Auf dieser Grundlage begründete wir, dass eine optimierte, standardisierte und reproduzierbare Protokoll, das zur TFH und GC B Zelldynamik in PPs Untersuchung wäre wertvoll für die Ermittler arbeiten zu diesem Thema. Diese Notwendigkeit gab uns den Anstoß, erzeugen eine verbesserte und aktuelle Protokoll für die Isolierung und Charakterisierung von PP-Lymphozyten, die fein für zelluläre Recovery, Rentabilität und Effizienz für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung der mehrere T- und B optimiert ist Zelle Teilmengen. Wir wollten auch auszuschließende mehrere aufwändige Vorbereitungsschritte vorgeschlagen in früheren Protokollen, damit Verringerung der erforderlichen Manipulationen und Zeit für Gewebe- und Vorbereitung von PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll für Durchfluss durchflusszytometrischen Charakterisierung von TFH und GC B Zellen optimiert. Einer der großen Vorteile unseres Protokolls ist, dass es die Isolation von bis zu 107 (durchschnittlich 4 – 5 x 106 Zellen) total PP Zellen aus einem einzigen Mausklick (C57BL/6-Stamm) ohne jede Verdauung ermöglicht. Wir beobachteten, dass die Ergebniszelle Ausbeute positiv mit der Anzahl der PPs korreliert war und aus die folgende einfache Gleichung, die hilfreich f?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Laura Strauss und Peter Salbei für hilfreiche Diskussionen und mit Flow Cytometry Analysen zu unterstützen.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
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