Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches
Summary
In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo es in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.
Abstract
In de mucosa van de darm vormen immune cellen een unieke immunologische entiteit, die, immuun tolerantie stimuleert terwijl gelijktijdig overdracht van het immuunsysteem verdediging tegen ziekteverwekkers. Het is reeds lang gevestigd dat Peyer van patches (KKS) een essentiële rol in de mucosal immune netwerk hebben door het hosten van verschillende effector T en B-cel subsets. Een bepaalde fractie van deze effector cellen, folliculaire T-helper (TFH) en germinal center (GC) B-cellen worden geprofessionaliseerd in de regulering van de Humorale immuniteit. Vandaar, omvat de karakterisering van deze deelverzamelingen van de cel binnen PPs in termen van hun differentiatie programma en functionele eigenschappen kan leveren belangrijke informatie over mucosale immuniteit. Daartoe zou een eenvoudig toepassing, efficiënte en reproduceerbare methode van lymfocyt isolatie van PPs waardevol voor onderzoekers. In deze studie, we gericht op het genereren van een effectieve methode om te isoleren van lymfocyten van muis PPs met hoge cel opbrengst. Onze aanpak bleek dat eerste weefsel verwerking zoals het gebruik van spijsvertering reagentia en weefsel agitatie, evenals cel kleuring voorwaarden en selectie van antilichaam panelen, grote invloed hebben op de kwaliteit en de identiteit van de geïsoleerde lymfocyten en op experimentele resultaten.
Hier beschrijven we een protocol waarmee onderzoekers efficiënt isoleren lymfocyt populaties van PPs waardoor reproduceerbare stroom cytometry gebaseerde beoordeling van T en B-cel subsets voornamelijk gericht op TFH en GC B cel subsets.
Introduction
Het hele maagdarmkanaal vanaf het begin tot het einde is versierd met een uitgebreid lymfoïde netwerk dat immune cellen meer dan enig andere orgel in mens en muis1 bevat. Peyer de patches (KKS) vormen een belangrijk onderdeel van de intestinale tak van deze cellulaire immuun organisatie, zogenaamde gut-geassocieerde lymfoïde weefsel (GALT)2,3. Binnen PPs, duizenden miljoenen antigenen afgeleid van dieet materialen, commensale microbiota en pathogenen worden continu bemonsterd en wanneer nodig passende immuunrespons naar hen zijn gemonteerd dus handhaving intestinale immuun homeostase. In die zin kunnen de KKS worden genoemd als “amandelen van de dunne darm”. KKS bestaan uit grote sub compartimenten: subepithelial koepel (SED), grote B-cel follikel zones; de bovenliggende follikel-geassocieerde epitheel (FAE) en de interfollicular regio (IFR) waar T-cellen gelegen4 zijn. Deze unieke compartimentering van PPs maakt het mogelijk verschillende effector cel deelverzamelingen om samen te werken, verleent dus immunocompetence in de darm.
KKS ontbreken afferent lymfatische, en vanwege deze reden niet antigenen vervoerd naar PPs van de dunne darm worden uitgevoerd via de lymfevaten in tegenstelling tot de meeste van de andere lymfoïde organen. In plaats daarvan, gespecialiseerde epitheliale cellen gelegen in FAE, zogenaamde M-cellen, zijn verantwoordelijk voor de overdracht van luminal antigenen in de KKS-5. Vervolgens, de vervoerde hoeveelheden antigenen worden opgepikt door de dendritische cellen (DC’s) en fagocyten die zich in de regio subepithelial koepel (SED) onder de FAE6,7 bevinden. Dit proces antigeen sorteren door DCs in de PP is cruciaal voor het initiëren van de aanpassings immune reactie8 en latere generaties van IgA dat cellen9.
Als gevolg van de zware last die antigene commensale flora en dieet materiaal, KKS host endogeen geactiveerd effector T en B-cel deelverzamelingen in grote abundanties zoals TFH en IgA+ GC B cellen10, suggereren dat PPs een site van actieve immune vertegenwoordigen antwoord11. Detectie van tot 20-25% TFH cellen binnen de totale CD4+ T cel compartiment en tot 10-15% GC B binnen totaal aantal B-cellen cellen is mogelijk in KKS verzameld van unimmunized jonge C57BL/6 muizen12. In tegenstelling tot de soorten van andere T-helper cellen (dwz., Th1, Th2, Th17 cellen), TFH cellen Toon unieke tropisme in B-cel follikels voornamelijk ten gevolge van CXCR5 expressie, die TFH cel homing langs CXCL13 kleurovergang13 bevordert. In de B-cel follikel zones van PPs induceren TFH cellen IgA klasse schakelaar recombinatie en somatische hypermutation in geactiveerde B-cellen waaruit hoge-affiniteit IgA producerende cellen14 onderscheiden. Vervolgens deze plasmacellen antilichaam-afscheidende migreren naar de lamina propria (LP) en immuun homeostase in de darm10regelen.
Identificatie en karakterisering van TFH en GC B-cel populaties binnen PPs onderzoekers te onderzoeken van de dynamiek van de humorale immuunreacties onder steady-state omstandigheden zonder de behoefte aan tijdrovende immunisatie modellen in staat kunnen stellen traditioneel gebruikt in TFH-GC B cel studies15,16,17,18. Analyseren van TFH cellen binnen PPs is niet zo eenvoudig als andere cel subsets. Technische uitdagingen omvatten ideale weefsel voorbereiding voorwaarden, oppervlakte antilichaam-marker combinatie, identificeren, alsmede passende positieve en negatieve controles selecteren. Zowel TFH en PP onderzoeksgebieden vertonen grote variabiliteit in termen van de experimentele procedures en zijn verre van overdracht van een consensus om gestandaardiseerde protocollen als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste neiging elke deelverzameling van de cel binnen PPs om differentieel door weefsel voorbereiding factoren vereisen verdere wijzigingen in een cel deelverzameling-specifieke manier worden beïnvloed. Ten tweede, is er een significante discrepantie tussen de gerapporteerde methoden met betrekking tot de details voor cel bereiding op basis van PPs. derde, het aantal protocol gebaseerde vergelijkende studies onderzoeken ideaal weefsel voorbereiding technieken en proefomstandigheden voor PP en TFH is onderzoek vrij beperkt.
Huidige protocol gebaseerde studies voorgesteld voor PP cel voorbereiding19,20,21,22 waren niet TFH- of GC B-cel-georiënteerd. Bovendien, sommige weefsel voorbereiding voorwaarden aanbevolen voor PPs19,20 zoals collagenase gebaseerde spijsvertering bleken de uitkomst van TFH identificatie negatief beïnvloeden door stroom cytometry18. Op deze basis redeneerde wij dat een geoptimaliseerde, gestandaardiseerde en reproduceerbare protocol dat kan worden gebruikt voor het bestuderen van TFH en GC B cel dynamiek binnen PPs zou waardevol zijn onderzoekers bezig met dit onderwerp. Deze behoefte gaf ons de impuls voor het genereren van een verbeterde en bijgewerkte protocol voor de isolatie en de karakterisering van PP lymfocyten die fijn is geoptimaliseerd voor cellulaire herstel, levensvatbaarheid en efficiëntie voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van verschillende T en B deelverzamelingen van de cel. We wilde ook uitsluiten van de verschillende stappen van de moeizame voorbereiding voorgesteld in eerdere protocollen, daardoor, vermindering van de vereiste manipulaties en tijd voor de voorbereiding van de weefsels en cellen van PPs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol dat is geoptimaliseerd voor de karakterisering van het cytometrische van de stroom van TFH en GC B cellen. Een van de grote voordelen van onze protocol is dat hierdoor het isolement van maximaal 107 (gemiddeld 4-5 x 106 cellen) totale PP cellen uit een enkele muis (C57BL/6-stam) zonder enige spijsvertering proces. We hebben vastgesteld dat de cel Totaal opbrengst was positief gecorreleerd met het aantal PPs en van de volgende eenvoudige vergelijking die nuttig is voo…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij wil Laura Strauss en Peter Sage dank voor nuttige discussies en steunen met stroom cytometry analyses.
Materials
| anti-mouse CD4 antibody | eBioscience, Biolegend* | 17-0041-81 ,10054* | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CD19 antibody | eBioscience | MA5-16536 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse PD-1 antibody | eBioscience | 61-9985-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse ICOS antibody | eBioscience | 12-9942-82 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse GL7 antibody | Biolegend | 144610 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse CXCR5 antibody | Biolegend*, BD Bioscience | 145512*, 551960 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse BCL-6 antibody | Biolegend | 358512 | For detailed information see Table 1 |
| anti-mouse Foxp3 antibody | eBioscience | 17-5773-82 | For detailed information see Table 1 |
| Streptavidin-BV421 | BD Bioscience | 563259 | For detailed information see Table 1 |
| FixableViability Dye | eBioscience | L34957 | For detailed information see Table 1 |
| 7AAD | Biolegend | 420404 | For detailed information see Table 1 |
| FcBlock (CD16/32) | BD Bioscience | 553141 | For detailed information see Table 1 |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | |
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 6-well,12-well & 96-well plates | Falcon/Corning | 353046,353043/3596 | |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 10 ml syringe-plunger | Exel INT | 26265 | |
| RPMI | Corning | 15-040-CV | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Orbital shaker | VWR | Model 200 | |
| Curved-end scissor | |||
| Fine Serrated Forceps | |||
| Small curved scissor |
Referencias
- van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29 (5), 203-206 (2008).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271 (1), 230-245 (2016).
- Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12 (2), 122-136 (1997).
- Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413 (6856), 639-643 (2001).
- Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2 (1), 59-68 (2000).
- Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer’s patches. Infection and Immunity. 71 (1), 504-509 (2003).
- Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (12), 1333-1338 (2005).
- Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247 (1), 97-116 (2012).
- Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
- Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462 (7270), 226-230 (2009).
- Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195 (5), 2080-2089 (2015).
- Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5 (11), 853-865 (2005).
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
- Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44 (6), 1350-1364 (2016).
- Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45 (4), 831-846 (2016).
- Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 815-825 (2018).
- Espéli, M., Walker, J. M. . T follicular helper cells – Methods and Protocols. , (2015).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
- Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4 (21), e1282 (2014).
- Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
- Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27 (8), 3008-3022 (2007).
- Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109 (22), 8664-8669 (2012).
- Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
- Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36 (7), 410-418 (2015).
- Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236 (1-2), 27-35 (2000).
- Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40 (2), 241-246 (1997).
- Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8 (5), 1072-1082 (2015).
- Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17 (3), 277-285 (2016).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33 (S1), (2017).
- Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177 (11), 7772-7783 (2006).
- Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56 (2), 292-296 (1975).
- Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424 (6944), 88-93 (2003).
- Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352 (6287), (2016).
