Summary
بروتوكول للعدوى الوقس من خلايا هيلا وتحليل المضيف والفيروسية التعبير الجيني. الجزء 2 من 3.
Abstract
الأسرة
Protocol
الجزء 1 : [كدنا] تجميع من الحمض النووي الريبي
- قبل استخدام Ambion الأمينية الآليل MessageAmp الثاني عدة ، إضافة الحجم الموصى بها من الإيثانول بنسبة 100 ٪ للمخازن الغسيل.
- في أنبوب تفاعل PCR ، إضافة إلى 5μg بين 100ng من الحمض النووي الريبي و1μl من مجموع التمهيدي T7 (DT) بنسبة ضئيلة. جعل حجم ما يصل الى 12μl مع nuclease خالية من المياه.
- احتضان العينات عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في thermocycler.
- إزالة عينات الحمض النووي الريبي من 70 درجة مئوية ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة. مكان على الجليد.
- يعد شارع ستراند 1 التجميعي الرئيسي مزيج والحفاظ على درجة حرارة الغرفة (مع 10 ٪ عن الفائض pipetting الخطأ) (الجدول 1)
- بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
- نقل 8μl من مزيج ماجستير في كل عينة الحمض النووي الريبي. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
- في احتضان 42 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler.
- الطرد المركزي عينات لفترة وجيزة ووضع على الجليد. الشروع فورا في الخطوة التالية من التوليف dsDNA.
- إعداد ستراند الثانية 2 التجميعي مزيج الرئيسي على الجليد (مع الفائض بنسبة 10 ٪ لpipetting الخطأ) (الجدول 2)
- بلطف ماصة ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة.
- نقل 80μl لكل عينة والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات.
- في احتضان 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في thermocycler.
- بعد حضانة 2 ساعة ، والمضي قدما في خطوة لتنظيف [كدنا] أو تجمد على الفور في -20 درجة مئوية.
الجزء 2 : مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل [كدنا] تنظيف
- إزالة الصرفة [كدنا] من الثلاجة والسماح لها لكي تتوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام. يهز زجاجة لresuspend تماما المغناطيسي الخرز ملزم [كدنا] قبل الاستخدام.
- قسامة nuclease خالية من الماء في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل خلال حضانة لل2hr السابقة.
- إضافة 180μl البحتة [كدنا] لكل عينة ، ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا. نقل العينات إلى لوحة الجولة القاع 96 - جيدا.
- الاستمرار في خلط العينات التي تهز برفق على لوحة شاكر المداري ما لا يقل عن 2 دقيقة.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف لحوالي 6 دقائق ، أو حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا] إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. والخرز NOT تفريق في هذه الخطوة ، نظرا لانخفاض التوتر السطحي للالعازلة يغسل.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- تكرار غسل مرة الثانية مع 2 150μl الاحتياطي اغسل [كدنا].
- بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 2 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry!
- أزل [كدنا] من الخرز بإضافة 18μl الماء nuclease خالية محمى على كل عينة.
- هزة بقوة لوحة لمدة 3 دقائق على شاكر المداري ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
- مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي.
- نقل بعناية eluted [كدنا] (~ 16μl) لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
- الانتقال مباشرة إلى الخطوة التالية ، أو تجميد [كدنا] في -20 درجة مئوية.
الجزء 3 : النسخ في المختبر (IVT)
- تحضير مزيج الرئيسي IVT في درجة حرارة الغرفة (الجدول 3)
- ماصة بلطف ميكس ماجستير أو نفض الغبار إلى المزيج ، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
- إضافة إلى كل 24μl العينة ، والمزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 14 ساعة في thermocycler ، ثم اضغط على 4 درجات مئوية حتى على استعداد لاتخاذ الخطوة التالية.
الجزء 4 : آرنا تنظيف بعد IVT
- دوامة حبات الحمض النووي الريبي ملزمة لفترة وجيزة للحصول على مزيج حتى قبل استخدامها.
- تحضير مزيج آرنا ملزم في درجة حرارة الغرفة (الجدول 4) ويمكن القيام بذلك في وقت مبكر -- ويمكن تخزين هذا المزيج أعد ملزمة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- مزيج جيد من قبل vortexing.
- قسامة شطف آرنا الاحتياطي في أنبوب 1.5mL واحتضان في 50-60 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
- إضافة 70μl من مزيج آرنا ملزملكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
- نقل عينات من لوحة إلى لوحة PCR جولة القاع 96 - جيدا.
- إضافة 50μl 100 ٪ الأيزوبروبانول لكل عينة ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-4 مرات.
- يهز بلطف على لوحة شاكر المداري على الأقل 2 دقيقة لمزيج دقيق العينات.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي. ترك لوحة على الوقوف حتى يصبح المزيج شفافة والخرز ومكعبات ملزمة.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- إضافة محلول الغسيل 100μl آرنا إلى كل بئر ويهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري بسرعة معتدلة. قد لا تفريق حبات تماما في هذه الخطوة.
- نقل لوحة الى وقفة لالتقاط المغناطيسي الخرز المغناطيسي.
- نضح بعناية طاف مع الشافطة فراغ من دون إزعاج الخرز المغناطيسي. بدلا من ذلك ، إزالة بعناية طاف مع ماصة وتجاهل طاف.
- إزالة لوحة من الوقوف المغناطيسي.
- تكرار غسل مرة الثانية مع الحل 2 100μl اغسل آرنا.
- بعد غسل الثانية 2 ، تجفيف الخرز التي تهز لوحة لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري في أقصى سرعة. لا overdry العينات!
- أزل في آرنا من الخرز بإضافة 40μl شطف آرنا محمى الاحتياطي على كل عينة.
- هزة بقوة على لوحة شاكر مدارية لمدة 3 دقائق ، ثم تحقق للتأكد من مشتتة تماما الخرز المغناطيسي. إذا لم يكن كذلك ، لا تزال تهتز.
- مرة واحدة حبات المغناطيسي قد فرقت بشكل كامل ، نقل الى وقفة لوحة المغناطيسي لالتقاط حبات المغناطيسي. وطاف يحتوي على آرنا أدرجت نيراتوفيتشي الأميني الآليل.
- نقل بعناية آرنا eluted لوحة PCR جديد (أو أنابيب PCR).
- (خطوة اختيارية) للتحقق من تركيز الحمض النووي الريبي من العينات عن طريق قياس 1.5μl على معمل NanoDrop.
- تواصل فورا على الخطوة التالية ، أو تخزين آرنا في -80 درجة مئوية.
الجدول رقم 1 : [كدنا] شارع ستراند 1 التجميعي ميكس ماجستير
| الكاشف | المبلغ : 1 رد الفعل |
| 10X الاحتياطي ستراند الأولى | 2 ميكرولتر |
| dNTP ميكس | 4 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز المانع | 1 ميكرولتر |
| مجموعة النصي | 1 ميكرولتر |
الجدول 2 : [كدنا] ستراند الثانية 2 التجميعي ميكس ماجستير
| الكاشف | المبلغ : 1 رد الفعل |
| Nuclease المياه مجانا | 63 ميكرولتر |
| 10X الاحتياطي ستراند الثانية | 10 ميكرولتر |
| dNTP ميكس | 4 ميكرولتر |
| بوليميراز الدنا | 2 ميكرولتر |
| ريبونوكلياز H | 1 ميكرولتر |
الجدول 3 : IVT ماجستير ميكس
| الكاشف | المبلغ : 1 رد الفعل |
| aaUTP حل (75 ملم) | 2 ميكرولتر |
| ATP ، CTP ، GTP مزيج (25 ملم) | 12 ميكرولتر |
| T7 UTP حل (75 ملم) | 2 ميكرولتر |
| T7 الاحتياطي الرد 10X | 4 ميكرولتر |
| T7 أنزيم ميكس | 4 ميكرولتر |
الجدول 4 : آرنا ميكس تجليد
| الكاشف | المبلغ : 1 رد الفعل |
| الخرز RNA ملزم * | 10 ميكرولتر |
| حبة * إعادة تعليق الحل | 4 ميكرولتر |
| 100 ٪ الأيزوبروبانول ** | 6 ميكرولتر |
| آرنا مركزة الاحتياطي تجليد | 50 ميكرولتر |
* مزيج من الحمض النووي الريبي ملزمة مع حبات الحل إعادة تعليق خرزة الأولى.
** إضافة الأيزوبروبانول وتخلط جيدا قبل إضافة تركز آرنا العازلة ملزمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة
لا ينصح الجولة الثانية من التضخيم كما لوحظت التحيز في البيانات صفيف. الاختلاط في كل خطوة بعناية الأنزيمية (1 و 2 ش التوليف حبلا الثانية [كدنا] ، IVT) أمر حاسم للحصول غلة جيدة التضخيم ، كما هو احتضان كل خطوة الأنزيمية في درجة حرارة مناسبة. A cycler PCR مع غطاء قابل للتعديل ساخنة يفضل -- حتى الانحرافات صغيرة مثل 2-3 درجات خلال IVT في فرن الهواء أو الماء التهجين تهجين الحمام يمكن أن تؤثر بشكل كبير العائد من الناتج تضخيمها.
التطبيق / أهمية
يمكن تهجين الحمض النووي الريبي المسمى الناتجة عن هذا البروتوكول لميكروأرس البشرية والفيروسية ، أو مخصصة لتقييم الاستجابات التعبير الجيني للخلايا المصابة في الثقافة. منصات ميكروأري تختلف ، لذلك اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإعداد خليط من التهجين المسبار المسمى.
باستخدام مجموعة مخصصة الفيروسة الجدرية مصممة 1 ، تمكنا من جينات وراثية في تصنيف فئات عامة من "المبكر" أو "المتأخرة" استنادا إلى توقيت إشارة التهجين وعما إذا كانت أو لم تكن مطلوبة تكرار الحمض النووي الفيروسي للكشف عن نص. لاحظنا في الفئات الوظيفية المتوقعة من الجينات في كل فئة الزمنية (أي في وقت مبكر من المتوقع الجينات والمتوسطة والمتأخرة) والاختلاف في التوقيت الدقيق لالنسخ.
الأساليب المستخدمة في هذا العمل هي قادرة على التنبؤ جينات فيروس كتب في وقت مبكر أو في وقت متأخر من دورة النسخ المتماثل ، ولكن لديها أكثر صعوبة في التمييز المبكر فقط مقابل الجينات مع المروج المبكرة والمتأخرة منذ النصوص مع المروج المبكر / أواخر المزدوج قد تستمر وتكون الكشف في أوقات متأخرة. بالإضافة إلى ذلك ، قد تعمل من خلال النسخ من الجينات الفيروسية أواخر تؤثر في إشارة التحقيق معين / بقعة على طائفة ، لأن التهجين الحمض النووي الريبي إلى الصفيف قد تأتي من ORF ORF المعينة أو المنبع. صفائف تبليط حاولت حل هذه المشكلة ، ولكن التحديات لا تزال قائمة في كشف من خلال تشغيل النسخ التهجين باستخدام نهج يستند 2،3،4.
ويمكن أيضا أنماط الترانسكربتي المضيف يتم تقييمها باستخدام هذه الأساليب. ومع ذلك ، الوقس بترميز مجموعة متنوعة من الآليات لكبح ردود المضيفة ، وربما يكون تناقص ردود المضيف الترانسكربتي مقارنة مع غيرها من المحفزات 5،6،7،8. منذ يتم تبديل التعبير عن العديد من الجينات تشارك في الدفاع المضيف بعد الإصابة ، ينبغي بالتالي مساهمة الجينات الفيروسية التي مواجهة الاستجابات المناعية للمضيف أن تؤخذ بعين الاعتبار.
باستخدام هذه الأساليب ، ويمكن التعرف على خريطة توقيت الترانسكربتي جميع الجينات الفيروسية وتستخدم لاستجواب وظائف الجينات الفيروسية مجهولة. بالإضافة ، يمكن أن تستخدم هذه الأساليب لتشريح الحوار المعقدة بين الفيروس والمضيف. هذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنظمة أخرى العدوى المضيف الممرض. إذا لا فائدة من الممرض ومذيل بعديد الأدينيلات mRNAs ، يمكن استخدام أساليب بديلة لتسمية مباشرة على الحمض النووي الريبي مجموع ، دون تضخيم الخطية. من خلال تحليل كل من المضيف وفيروس التعبير الجيني خلال العدوى المتزامنة ، وهذه الأساليب تسمح لنا لاكتساب نظرة ثاقبة فيروس التفاعل مع البيئة المضيف الخلوية وكذلك استضافة دفاعات مضادة ضد عدوى الفيروس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
معهد وايتهيد زملاء صناديق
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
