Summary
Protokoll zur Vaccinia-Infektion von HeLa-Zellen und die Analyse von Host-und virale Genexpression.
Abstract
Die Familie
Protocol
Teil 1: cDNA-Synthese aus RNA
- Vor der Verwendung der Ambion Amino Allyl MessageAmp II Kit, fügen Sie die empfohlene Menge von 100% Ethanol zu dem Waschpuffer.
- In PCR-Gefäß, fügen Sie zwischen 100 ng bis 5μg Gesamt-RNA und 1μl der T7-Oligo (dT)-Primer. Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 12μl mit Nuklease-freiem Wasser.
- Inkubieren Proben bei 70 ° C für 10 min in einem Thermocycler.
- Entfernen RNA-Proben von 70 ° C und kurz zentrifugieren. Auf Eis legen.
- Bereiten Sie die 1. Strand Synthesis Master-Mix und halten bei Raumtemperatur (mit 10% Überschuss zum Pipettieren Fehler). (Tabelle 1)
- Gently Pipette Master Mix-oder Springmesser, zu mischen, und dann kurz zentrifugieren.
- Transfer 8μl des Master Mix zu jeder RNA-Probe. Mix von Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
- Inkubation bei 42 ° C für 2 Stunden in Thermocycler.
- Centrifuge Proben kurz auf Eis stellen. Unmittelbar mit dem nächsten Schritt der dsDNA Synthese fort.
- Bereiten Sie die 2 nd Strand Synthesis Master-Mix auf Eis (mit 10% Überschuss zum Pipettieren Fehler). (Tabelle 2)
- Gently Pipette Master Mix-oder Springmesser, zu mischen, und dann kurz zentrifugieren.
- Transfer-80μl jeder Probe und sanft durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen.
- Inkubation bei 16 ° C für 2 Stunden in Thermocycler.
- Nach dem 2 Stunden Inkubation mit der cDNA clean-up Schritt fort oder einfrieren sofort bei -20 ° C.
Teil 2: Double-cDNA clean-up
- Entfernen Sie die cDNA pur aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur für 30 Minuten vor dem Einsatz ausgleichen. Schütteln Sie die Flasche voll resuspendieren der magnetischen cDNA verbindliche Perlen vor der Verwendung.
- Aliquot Nuklease-freiem Wasser in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten während der letzten 2 Std. Inkubation.
- Fügen Sie 180μl der cDNA pur zu jeder Probe und gründlich durch Auf-und Abpipettieren mischen. Übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-Rundboden-Platte.
- Weiter zu den Proben durch leichtes Schütteln der Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten mischen.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Platte auf den Ständer für ca. 6 Minuten, oder bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Add 150 &mgr; l cDNA Waschpuffer in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen werden zu diesem Schritt zu zerstreuen, wegen der niedrigen Oberflächenspannung des Waschpuffer.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Wiederholen Sie die Wäsche ein 2. Mal mit 150 &mgr; l cDNA-Waschpuffer.
- Nach dem 2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 2 Minuten auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen!
- Eluieren der cDNA von den Perlen, indem 18μl der vorgewärmten Nuklease-freies Wasser zu jeder Probe.
- Kräftig schütteln, die Platte für 3 Minuten auf dem Schüttler, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern.
- Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen.
- Sorgfältig Übertragung der eluierten cDNA (~ 16μl) in ein neues PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen).
- Gehen Sie direkt zum nächsten Schritt, oder frieren die cDNA bei -20 ° C.
Teil 3: In-vitro-Transkription (IVT)
- Bereiten Sie das IVT Master-Mix bei Raumtemperatur. (Tabelle 3)
- Gently Pipette die Master Mix-oder Springmesser, zu mischen und kurz zentrifugieren.
- Add 24μl jeder Probe und sanft durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen.
- Bei 37 ° C für 14 Stunden in einem Thermocycler, dann bei 4 ° C bis bereit für den nächsten Schritt zu halten.
Teil 4: aRNA clean-up nach IVT
- Vortex die RNA-Bindung Perlen kurz, um eine gleichmäßige Mischung vor Gebrauch zu erhalten.
- Bereiten Sie die aRNA Binding Mix bei Raumtemperatur (Tabelle 4) Das vor der Zeit getan werden kann -. Die vorbereitete verbindliche Mischung kann bei Raumtemperatur gelagert werden bis zu einer Woche.
- Gut mischen durch Vortexen.
- Aliquot der aRNA Elutionspuffer in ein 1,5 ml Röhrchen und inkubieren bei 50-60 ° C für mindestens 10 Minuten.
- Fügen Sie 70μl der aRNA verbindliche Mixzu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
- Übertragen Sie die Proben aus der PCR-Platte, eine 96-Well-Rundboden-Platte.
- Add 50 ul 100% Isopropanol zu jeder Probe und mischen Sie gut durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal.
- Schütteln Sie die Platte auf einem Schüttler für mindestens 2 Minuten gründlich mischen der Proben.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Lassen Sie die Platte auf dem Stand, bis die Mischung wird transparent und die Bindung Perlen haben pelletiert.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Add 100 &mgr; aRNA Waschlösung in jede Kavität der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei mäßiger Geschwindigkeit. Perlen können nicht vollständig in diesem Schritt zu zerstreuen.
- Bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen.
- Vorsichtig absaugen der Überstand mit einem Vakuum-Sauger, ohne die magnetischen Kügelchen. Alternativ vorsichtig den Überstand mit einer Pipette und den Überstand verwerfen.
- Die Platte aus dem magnetischen stehen.
- Wiederholen Sie die Wäsche ein 2. Mal mit 100 &mgr; aRNA Waschlösung.
- Nach dem 2. waschen, trocknen die Kügelchen durch Schütteln der Platte für 1 Minute auf dem Schüttler bei maximaler Geschwindigkeit. Nicht übertrocknen Proben!
- Eluieren aRNA von den Perlen, indem 40 ul vorgewärmte aRNA Elutionspuffer zu jeder Probe.
- Kräftig schütteln, die Platte auf dem Schüttler für 3 Minuten, dann überprüfen Sie, ob die magnetischen Beads vollständig verteilt sind. Wenn nicht, weiter zittern.
- Nachdem die magnetischen Beads vollständig zerstreut haben, bewegen Sie die Platte zu einem magnetischen stehen, um die magnetischen Kügelchen zu erfassen. Der Überstand enthält das gereinigte-up Amino-allyl eingebaut aRNA.
- Sorgfältig Übertragung der eluierten aRNA einen neuen PCR-Platte (oder PCR-Röhrchen).
- (Optionaler Schritt) Überprüfen Sie die RNA-Konzentration der Proben durch die Messung 1.5μl auf einem NanoDrop Spektralphotometer.
- Unmittelbar auf den nächsten Schritt fort, oder lagern Sie das aRNA bei -80 ° C.
Tabelle 1: cDNA 1 M. Strand Synthesis Master Mix
| Reagens | Betrag für 1-Reaktion |
| 10X First Strand Buffer | 2 ul |
| dNTP Mix | 4 ul |
| Ribonuclease Inhibitor | 1 ul |
| Array Script | 1 ul |
Tabelle 2: cDNA 2. Strand Synthesis Master Mix
| Reagens | Betrag für 1-Reaktion |
| Nuclease freies Wasser | 63 ul |
| 10X Zweiten Strand Buffer | 10 pl |
| dNTP Mix | 4 ul |
| DNA Polymerase | 2 ul |
| RNase H | 1 ul |
Tabelle 3: IVT Master Mix
| Reagens | Betrag für 1-Reaktion |
| aaUTP-Lösung (75 mM) | 2 ul |
| ATP, CTP, GTP-Mix (25 mM) | 12 ul |
| T7 UTP-Lösung (75 mM) | 2 ul |
| T7 10X Reaktionspuffer | 4 ul |
| T7-Enzym-Mix | 4 ul |
Tabelle 4: aRNA Binding Mix
| Reagens | Betrag für 1-Reaktion |
| RNA Binding Perlen * | 10 pl |
| Bead Resuspension Solution * | 4 ul |
| 100% Isopropanol ** | 6 ul |
| aRNA Binding Buffer Concentrate | 50 pl |
* Mix der RNA-Bindung Perlen mit der Raupe Resuspension Lösung zuerst.
** Fügen Sie das Isopropanol und gut mischen, bevor Sie die aRNA Bindungspuffer konzentrieren.
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Discussion
Kritische Schritte
Eine zweite Runde der Amplifikation wird nicht empfohlen, da Verzerrungen in Array-Daten beobachtet wurden. Mischen sorgfältig an jedem enzymatischen Schritt (1 st und 2 nd cDNA-Synthese, IVT) ist entscheidend für die Erzielung einer guten Verstärkung liefert, wie die Inkubation von jedem enzymatischen Schritt bei der entsprechenden Temperatur. Ein PCR-Cycler mit verstellbaren beheizten Deckel wird bevorzugt - auch Abweichungen so klein wie 2-3 Grad während IVT in einer Luft Hybridisierungsofen oder im Wasserbad Hybridisierung kann erhebliche Auswirkungen auf Ertrag von amplifizierten Produkts.
Anwendung / Bedeutung
Die markierte RNA aus diesem Protokoll kann von Menschen, virale oder benutzerdefinierte Microarrays hybridisiert werden, um die Genexpression Antworten auf infizierten Zellen in Kultur zu beurteilen. Microarray-Plattformen variieren, so folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die Vorbereitung der Hybridisierung Mischung aus markierten Sonde.
Mit einem maßgeschneiderten Pockenvirus Array 1, konnten wir Gene in die allgemeinen Kategorien von "früh" oder "Ende" auf Timing Hybridisierungssignal basiert und ob virale DNA-Replikation für die Niederschrift Nachweis erforderlich war zu klassifizieren. Wir beobachteten den erwarteten funktionalen Kategorien von Genen in jeder zeitlichen Klasse (dh voraussichtlich Anfang, mittleren und späten Gene), wie sie auf den genauen Zeitpunkt der Transkription.
Die Methoden in dieser Arbeit verwendet werden, sind in der Lage, Viren Gene transkribiert früh oder spät im Replikationszyklus vorherzusagen, aber sie haben Schwierigkeiten zu unterscheiden früh nur gegen Gene mit einer frühen und späten Promotor seit Transkripte mit einem Dual frühen / späten Promotor kann bestehen bleiben und werden erkannt zu späten Zeiten. Darüber hinaus können Durchlauf Transkription der späten viralen Gene Signal an einer bestimmten Sonde / Spot auf dem Array beeinflussen, wie die RNA hybridisiert, um das Array aus dem ausgewiesenen ORF oder eine vorgeschaltete ORF kommen kann. Tiling Arrays haben versucht, dieses Problem zu beheben, aber Herausforderungen bleiben bei der Erkennung durch Transkription mit Hybridisierung Ansätze 2,3,4 laufen.
Host transkriptionelle Muster können auch mit Hilfe dieser Methoden werden. Allerdings kodiert Vaccinia eine Vielzahl von Mechanismen, um Host-Reaktionen hemmen, und Host-transkriptionellen Reaktionen können im Vergleich zu anderen Reizen 5,6,7,8 vermindert werden. Da die Expression vieler Gene in Immunabwehr beteiligten nach der Infektion verändert ist, sollte der Beitrag der viralen Gene, die als Host Immunantwort entgegenwirken daher berücksichtigt werden.
Mit Hilfe dieser Methoden können eine Karte der Transkriptions-Timing aller viralen Gene identifiziert und genutzt werden, um Funktionen von unbekannten viralen Gene zu verhören. Darüber hinaus können diese Methoden genutzt, um die komplizierten Dialog zwischen Virus und Wirt sezieren werden. Diese Methoden sind im Großen und Ganzen auch für andere Wirt-Pathogen-Infektion Systeme. Wenn der Erreger von Interesse nicht mRNAs polyadenyliert haben, können alternative Methoden verwendet werden, um direkt beschriften Sie die Gesamt-RNA werden, ohne lineare Verstärkung. Durch die Analyse der Wirt und Virus Genexpression während der synchronen Infektion, erlauben diese Methoden uns einen Einblick in Virus-Interaktion zu gewinnen mit dem Host-zelluläre Umgebung sowie Host-Zähler-Abwehr gegen Virusinfektionen.
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Acknowledgments
Whitehead Institute Fellows Funds
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
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