Summary
Protocolo de Vaccinia la infección de células HeLa y el análisis de la acogida y la expresión de genes virales.
Abstract
La familia
Protocol
Parte 1: síntesis de cDNA a partir de ARN
- Antes de utilizar el Ambion Amino alil MessageAmp II kit, añadir el volumen recomendado de etanol al 100% a los tampones de lavado.
- En el tubo de reacción de PCR, añadir entre 100 ng de ARN total de 5μg y 1μl de T7 oligo (dT) primer. Llevar el volumen hasta 12μl con agua libre de nucleasa.
- Incubar las muestras a 70 ° C durante 10 minutos en un termociclador.
- Extraer muestras de ARN de 70 ° C y centrifugar brevemente. Coloque sobre hielo.
- Preparar la 1 ª Strand Síntesis mezcla maestra y mantener a temperatura ambiente (con un 10% por exceso de pipeteo error). (Tabla 1)
- Mezclar con cuidado la pipeta Maestro o película para mezclar y centrifugar brevemente.
- Transferencia 8μl de la Master Mix para cada muestra de ARN. Mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Se incuba a 42 ° C durante 2 horas en el termociclador.
- Muestras de centrifugar brevemente y el lugar en el hielo. Proceder de inmediato a la siguiente etapa de la síntesis de ADN de doble cadena.
- Preparar el 2 º Strand Síntesis mezcla maestra sobre el hielo (con un 10% por exceso de pipeteo error). (Tabla 2)
- Mezclar con cuidado la pipeta Maestro o película para mezclar y centrifugar brevemente.
- Transferencia de 80μl de cada muestra y mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Se incuba a 16 ° C durante 2 horas en el termociclador.
- Después de la incubación de 2 horas, proceder a la limpieza de cDNA paso o congelar inmediatamente a -20 ° C.
Parte 2: doble cadena de ADNc de limpieza
- Retire el cDNA puro de la nevera y deje que se equilibre a la temperatura ambiente durante 30 minutos antes de su uso. Agite la botella para volver a suspender totalmente las cuentas de unión magnética cDNA antes de su uso.
- Alícuota de agua libre de nucleasa en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos durante la incubación 2h anterior.
- Agregar 180μl de cDNA puro a cada muestra, y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo. Transferencia de las muestras a un 96 y placa de fondo redondo.
- Continúe mezclando las muestras agitando suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Deje la placa en el stand de aproximadamente 6 minutos o hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Añadir 150μl del buffer Lave cDNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Granos no se dispersan en este paso, debido a la baja tensión superficial de la solución de lavado.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Repetir el lavado una vez con tampón 2 de 150μl Lave cDNA.
- Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 2 minutos en el agitador orbital a la velocidad máxima. No seque en demasía!
- Eluir el cDNA de las cuentas mediante la adición de 18μl de la precalentado agua libre de nucleasa a cada muestra.
- Agitar enérgicamente el plato durante 3 minutos en el agitador orbital, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando.
- Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas.
- Transferir cuidadosamente la cDNA eluido (~ 16μl) a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR).
- Pasar directamente al siguiente paso, o congelar el cDNA a -20 ° C.
Parte 3: la transcripción in vitro (FIV)
- Prepare la mezcla maestra IVT a temperatura ambiente. (Tabla 3)
- Pipeta suavemente la mezcla maestra o película para mezclar y centrifugar brevemente.
- Añadir 24μl de cada muestra y mezclar cuidadosamente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Se incuba a 37 ° C durante 14 horas en un termociclador, a continuación, mantenga a 4 ° C hasta que esté listo para el siguiente paso.
Parte 4: ARNA limpieza después de IVT
- Vortex las cuentas de unión a ARN brevemente para obtener una mezcla homogénea antes de su uso.
- Prepare la mezcla ARNA unión a temperatura ambiente (Tabla 4) Esto se puede hacer antes de tiempo -. Preparada la mezcla de unión se pueden almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de una semana.
- Mezclar bien por agitación.
- Alícuota del ARNA Tampón de Elución en un tubo de 1,5 ml y se incuba a 50-60 ° C durante al menos 10 minutos.
- Añadir 70μl de la mezcla de ARNA vinculantea cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Transferencia de las muestras de la placa de PCR a una de 96 pozos de fondo redondo de la placa.
- Añadir 50μl de 100% de isopropanol a cada muestra y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Agitar suavemente la placa en un agitador orbital durante por lo menos 2 minutos para mezclar bien las muestras.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. Dejar la placa en el soporte hasta que la mezcla se vuelve transparente y las cuentas de enlace tienen gránulos.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Agregar 100μl solución de lavado ARNA a cada pocillo y agitar la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a una velocidad moderada. Cuentas puede no dispersarse en este paso.
- Mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas.
- Aspirar el sobrenadante cuidadosamente con una aspiradora sin molestar a los granos magnéticos. Por otra parte, retirar con cuidado el sobrenadante con una pipeta y descartar el sobrenadante.
- Retire la placa del soporte magnético.
- Repita el lavado de un tiempo de 2 ª con la solución de lavado 100μl ARNA.
- Después del lavado 2 º, seca los granos al sacudir la placa durante 1 minuto en un agitador orbital a la velocidad máxima. No resecar las muestras!
- Eluir el ARNA de las cuentas mediante la adición de 40μl Buffer precalentado elución ARNA a cada muestra.
- Agite la placa para la placa en un agitador orbital durante 3 minutos, a continuación, comprobar para asegurarse de que los granos magnéticos son totalmente dispersos. Si no, continuar agitando.
- Una vez que las partículas magnéticas se han dispersado totalmente, mover la placa en un soporte magnético para capturar las bolas magnéticas. El sobrenadante contiene el limpiada amino-alil ARNA incorporado.
- Transferir cuidadosamente la ARNA eluye a una nueva placa de PCR (o los tubos de PCR).
- (Paso opcional) Comprobar la concentración de ARN de las muestras mediante la medición en un espectrofotómetro 1.5μl NanoDrop.
- Inmediatamente continuar con el siguiente paso, o almacenar el ARNA a -80 ° C.
Tabla 1: 1 Strand cDNA síntesis st Master Mix
| Reactivo | Importe para una reacción |
| Buffer 10X primer capítulo | 2 l |
| dNTP Mix | 4 l |
| Inhibidor de ribonucleasa | 1 l |
| Matriz de secuencias de comandos | 1 l |
Tabla 2: 2 Strand cDNA síntesis º Master Mix
| Reactivo | Importe para una reacción |
| Nucleasa agua libre | 63 l |
| Buffer 10X segunda línea | 10 l |
| dNTP Mix | 4 l |
| ADN polimerasa | 2 l |
| RNasa H | 1 l |
Tabla 3: IVT Master Mix
| Reactivo | Importe para una reacción |
| aaUTP solución (75 mM) | 2 l |
| ATP, CTP, GTP mix (25 mM) | 12 l |
| T7 solución UTP (75 mM) | 2 l |
| T7 tampón de reacción 10X | 4 l |
| T7 Enzyme Mix | 4 l |
Tabla 4: Mezclar ARNA Encuadernación
| Reactivo | Importe para una reacción |
| * Cuentas de unión a ARN | 10 l |
| Resuspensión de bolas * Solución | 4 l |
| 100% de isopropanol ** | 6 l |
| ARNA Concentrado tampón de unión | 50 l |
* Mezclar los granos de unión a ARN con la solución de resuspensión primer cordón.
** Agregue el isopropanol y mezclar bien antes de añadir el concentrado de tampón de unión ARNA.
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Discussion
Los pasos críticos
Una segunda ronda de amplificación no se recomienda como sesgos en la matriz de datos se han observado. Mezclando con cuidado en cada paso enzimático (1 º y 2 º capítulo de síntesis de cDNA, IVT) es fundamental para obtener buenos rendimientos de amplificación, ya que es la incubación de cada paso enzimático a la temperatura adecuada. Un termociclador de PCR con tapa térmica ajustable se prefiere - incluso desviaciones tan pequeñas como 2-3 grados durante la FIV en un horno de hibridación de aire o la hibridación baño de agua puede afectar significativamente el rendimiento del producto amplificado.
Application / Importancia
El ARN marcado como resultado de este protocolo puede ser hibridado con microarrays humanos, viral, o la costumbre de evaluar las respuestas de la expresión génica de las células infectadas en la cultura. Plataformas de microarrays varían, así que siga las instrucciones del fabricante para la preparación de la mezcla de hibridación de la sonda marcada.
El uso de un conjunto personalizado diseñado un virus de la viruela, hemos sido capaces de clasificar los genes en las categorías generales de "principios" o "finales" sobre la base de sincronización de la señal de hibridación y si la replicación del ADN viral se requiere para la detección de la transcripción. Hemos observado las categorías espera funcional de los genes en cada clase temporal (es decir, que se espera genes temprana, intermedia y tardía) variación en cuanto al momento exacto de la transcripción.
Los métodos utilizados en este trabajo son capaces de predecir los genes de virus de la transcripción temprano o tarde en el ciclo de replicación, pero tienen más dificultades para distinguir las primeras sólo frente a los genes con un promotor de principios y finales desde las transcripciones con un doble temprano / tardío promotor puede persistir y detectados en los tiempos finales. Además, la ejecución a través de la transcripción de finales de los genes virales pueden afectar a la señal en un sondeo determinado / lugar en la matriz, como el ARN que hibrida con la matriz puede haber venido de la ORF designado o aguas arriba ORF. Arreglos de baldosas han tratado de resolver este problema, sin embargo, sigue habiendo dificultades en la detección de ejecutar a través de la transcripción mediante enfoques basados en la hibridación 2,3,4.
Patrones de hosts de la transcripción también se pueden evaluar mediante estos métodos. Sin embargo, la vacuna codifica una variedad de mecanismos para inhibir las respuestas del huésped, y las respuestas de acogida de la transcripción puede ser disminuida en comparación con otros estímulos 5,6,7,8. Dado que la expresión de muchos genes implicados en la defensa del huésped se altera después de la infección, la contribución de los genes virales que contrarrestan las respuestas inmunitarias del huésped por lo tanto, deben ser tomados en consideración.
La utilización de estos métodos, un mapa de la fecha de la transcripción de los genes virales pueden ser identificadas y utilizadas para interrogar a las funciones de los genes virales desconocidas. Además, estos métodos pueden ser utilizados para analizar el diálogo entre los intrincados virus y el huésped. Estos métodos son ampliamente aplicables a otros sistemas de infección huésped-patógeno. Si el agente patógeno de interés no tiene poliadenilado ARNm, los métodos alternativos se pueden utilizar para etiquetar directamente el ARN total, sin amplificación lineal. Al analizar tanto el anfitrión como la expresión de genes del virus durante la infección sincrónica, estos métodos nos permiten comprender mejor la interacción del virus con el medio ambiente celular del huésped, así como defensas del huésped contra la infección del virus.
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Acknowledgments
Los becarios del Instituto Whitehead Fondos
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1753 | For 20 reactions |
| Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit | Reagent | Applied Biosystems | AM1821 | For 100 reactions, in a 96-well format |
| NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer | Other | NanoDrop | ND-1000 | Or equivalent spectrophotometer |
References
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
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- Satheshkumar, P. S., Moss, B.
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