Identificatie van eiwit-complexen met kwantitatieve proteomics in S. cerevisiae

Summary

Hier beschrijven we een nieuwe kwantitatieve proteomics-techniek voor het identificeren van eiwitcomplexen in Saccharomyces cerevisiae. In deze studie hebben we gebruik gemaakt van de SILAC methode, samen met affiniteit zuivering, gevolgd door tandem massaspectrometrie te identificeren met een hoge specificiteit van de binding partners van een ER-eiwit, Scs2p.

Abstract

Vetten zijn de bouwstenen van de cellulaire membranen die als barrières en in compartimentering van cellulaire processen, en sinds kort, net zo belangrijk intracellulaire signaalmoleculen. Echter, in tegenstelling tot eiwitten, lipiden zijn kleine hydrofobe moleculen die het verkeer in de eerste plaats door slecht beschreven nonvesicular routes, die worden verondersteld voor te komen bij membraan contact sites (MCSS). MCSS zijn regio's waar het endoplasmatisch reticulum (ER) direct fysiek contact maakt met een partnering organel, bijvoorbeeld, plasmamembraan (PM). De ER deel van de ER-PM MCSS is verrijkt met lipide-synthese enzymen, wat suggereert dat lipide-synthese is gericht op deze sites en implicerend dat MCSS van belang zijn voor lipide verkeer. Gist is een ideaal model om ER-PM MCSS studie omwille van hun overvloed, met meer dan 1000 contacten per cel, en hun geconserveerd natuur in al eukaryoten. Het blootleggen van de eiwitten die MCSS vormen is van cruciaal belang om te begrijpen hoe lipiden verkeer gebeurt in de cellen, en hoe ze handelen als signaalmoleculen. We hebben vastgesteld dat een ER geroepen Scs2p lokaliseren aan ER-PM MCSS en is belangrijk voor hun vorming. We zijn gericht op het blootleggen van de moleculaire partners van Scs2p. Identificatie van eiwit complexen steunt traditioneel op de eerste het oplossen van gezuiverde eiwit monsters door gel elektroforese, gevolgd door in-gel vertering van eiwitten bands en de analyse van peptiden met behulp van massaspectrometrie. Dit beperkt vaak de studie om een ​​kleine subset van eiwitten. Ook zijn eiwitcomplexen blootgesteld aan denaturering of niet-fysiologische omstandigheden tijdens de procedure. Om deze problemen te omzeilen, hebben we een grootschalig kwantitatief proteomics techniek om onpartijdige en gekwantificeerde gegevens te extraheren. We maken gebruik van stabiele isotopen de etikettering met aminozuren in cel cultuur (SILAC) te nieten isotoop kernen op te nemen in eiwitten in een niet-gelabelde controle stam. Gelijke volumes gelabeld cultuur en niet-gecodeerde, SILAC-label cultuur worden vermengd en gelyseerd door malen in vloeibare stikstof. We voeren vervolgens een affiniteitszuivering procedure om pull-down eiwitcomplexen. Ten slotte hebben we het eiwit neerslag monster, die klaar is voor analyse door high-performance vloeistofchromatografie / tandem massaspectrometrie. Nog belangrijker, worden eiwitten in de controle stam gelabeld door de zware isotoop en zal een massa / lading shift die kan tegen de niet-gelabelde eiwitten worden gekwantificeerd in het aas stam te produceren. Daarom kunnen verontreinigingen of niet-specifieke binding gemakkelijk kunnen worden verwijderd. Door deze aanpak, hebben we een aantal nieuwe eiwitten die lokaliseren aan ER-PM MCSS. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van onze aanpak.

Protocol

Materialen en methoden Giststammen Alle stammen die in deze studie zijn gebaseerd op de BY4742 achtergrond. De SILAC controle stam (Mat een, his3, leu2, ura3, lys2 en Arg4:: G418) werd gemaakt door voortplanting Arg4 verwijdering stam (Mat een, his3, ura3, leu2 en Arg4:: G418) naar BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 en lys2), en de meiotische haploiden werden verkregen door tetrade dissectie. Dat de controle op stam is een auxotroph voor lysine en arginine. Het aa…

Discussion

De fracties opgeslagen tijdens de zuivering procedure moet omvatten (1) pre-gewist cellysaat, (2) gebonden fractie, (3) niet-gebonden fractie, en (4) geëlueerd fractie. Wij raden aan het analyseren van het eiwit inhoud van de bovenstaande aliquots door Western blotting gebruik van anti-TAP antilichaam of zilverkleuring om de binding en het elueren van de efficiëntie van het experiment weer te geven. Voorbeelden van een zilveren gekleurde gel en een blot worden weergegeven in Figuur 1.

Sind…