تحديد بروتين المجمعات مع كمية البروتينات في البيرة س.
Summary
نحن هنا وصف تقنية جديدة لتحديد كمية البروتينات البروتين في المجمعات الجعوية السكيراء. في هذه الدراسة ، وقد استخدمنا أسلوب SILAC مع تنقية تقارب تليها بالترادف الطيف الكتلي لتحديد نوعية عالية مع الشركاء ملزمة للبروتين ER ، Scs2p.
Abstract
الدهون هي لبنات بناء الأغشية الخلوية التي تعمل كحواجز وتجزئة العمليات الخلوية ، ومؤخرا ، كما يشير الى جزيئات هامة بين الخلايا. لكن ، على عكس البروتينات ، والدهون هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور أن الاتجار في المقام الأول عبر طرق سيئة nonvesicular صفها ، والتي يفترض أن تحدث في مواقع الاتصال غشاء (MCSS). MCSS هي المناطق التي تكون فيها شبكية هيولي باطني (ER) يجعل الاتصال الجسدي المباشر مع العضية الشراكة ، مثل غشاء البلازما (بعد الظهر). تم تخصيب جزء من ER ER – PM – MCSS في أنزيمات الدهون التوليف ، مما يشير إلى أن يتم توجيه توليف الدهون لهذه المواقع ، ومما يدل على أن MCSS مهمة لحركة الدهون. الخميرة هو نموذج مثالي لدراسة ER – PM MCSS بسبب وفرة فيها ، مع أكثر من 1000 اتصال في كل خلية ، وطبيعتها الحفظ في جميع حقيقيات النوى. الكشف عن البروتينات التي تشكل MCSS أمر بالغ الأهمية لفهم كيف يتم إنجاز حركة الدهون في الخلايا ، وكيف يتصرفون كما يشير الجزيئات. لقد وجدنا أن ER دعا إلى توطين Scs2p ER – PM MCSS والمهم لتشكيلها. نحن نركز على الكشف عن شركاء الجزيئي للScs2p. تحديد بروتين المجمعات تعتمد تقليديا على حل اول عينات البروتين يطهر هلام إستشراد ، تليها في هلام هضم البروتين العصابات وتحليل الببتيدات بواسطة مطياف الكتلة. وهذا يحد كثيرا من دراسة لمجموعة فرعية صغيرة من البروتينات. أيضا ، ويتعرض لتغيير طبيعة البروتين المجمعات أو ظروف غير الفسيولوجية أثناء العملية. للتحايل على هذه المشاكل ، ونفذنا واسعة النطاق الكمي البروتيوميات تقنية لاستخراج البيانات غير منحازة وكميا. نستخدم الوسم النظائر مستقرة مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) لدمج أنوية النظائر الأساسية في البروتينات في سلالة تحكم معلم. يتم خلط كميات متساوية من ثقافة المفتاحية ومعلم ، والثقافة SILAC المسمى معا وlysed قبل الطحن في النيتروجين السائل. نحن ثم تنفيذ إجراء تنقية تقارب لهدم المجمعات البروتين. وأخيرا ، فإننا يعجل عينة البروتين ، والذي هو على استعداد لتحليلها من قبل اللوني السائل عالي الأداء / مطياف الكتلة جنبا إلى جنب. الأهم من ذلك ، وصفت البروتينات في سلالة سيطرة النظائر الثقيلة وسوف ينتج التحول الشامل / التهمة التي يمكن قياسها كميا ضد بروتينات غير المسماة في سلالة الطعم. لذا ، يمكن الملوثات ، أو غير محددة ملزمة القضاء عليها بسهولة. باستخدام هذا النهج ، حددنا البروتينات الرواية عدة لتوطين ER – PM MCSS. هنا نقدم وصفا مفصلا لنهجنا.
Protocol
Discussion
ينبغي أن aliquots حفظ أثناء إجراء تنقية ما يلي : (1) lysate الخلية قبل تطهيرها ، (2) جزء محدد ، (3) جزء غير منضم ، و (4) جزء eluted. نوصي تحليل محتويات البروتين من aliquots أعلاه الغربية النشاف استخدام الألغام المضادة TAP الضد أو تلطيخ الفضة لتعكس كفاءة ملزمة ويبلغ حجمه من التجربة. وترد أمثل?…
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 .
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 .
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , 123-125 .
