Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Summary

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Abstract

Los lípidos son los componentes de las membranas celulares que funcionan como barreras y en la compartimentación de los procesos celulares, y recientemente, como importantes moléculas de señalización intracelular. Sin embargo, a diferencia de las proteínas, los lípidos son pequeñas moléculas hidrofóbicas que el tráfico sobre todo por el mal descrito rutas nonvesicular, que son la hipótesis de que se produzca en los sitios de contacto con la membrana (MCS). MCS son las regiones donde el retículo endoplasmático (ER) se pone en contacto físico directo con una asociación orgánulos, por ejemplo, la membrana plasmática (PM). La porción de ER ER-PM MCS se enriquece en la síntesis de lípidos, enzimas, lo que sugiere que la síntesis de lípidos se dirige a estos sitios y lo que implica que los SCM son importantes para el tráfico de lípidos. La levadura es un modelo ideal para estudiar ER-PM MCS debido a su abundancia, con más de 1.000 contactos por celular, y su naturaleza se conserva en todos los eucariotas. Descubrimiento de las proteínas que constituyen la MCS es fundamental para la comprensión de cómo el tráfico de lípidos se lleva a cabo en las células, y la forma en que actúan como moléculas de señalización. Hemos encontrado que una llamada ER Scs2p localizar a ER-PM MCS y es importante para su formación. Nos hemos centrado en el descubrimiento de los socios de Scs2p molecular. Identificación de los complejos de proteínas tradicionalmente se basa en la primera resolución de muestras purificadas de proteínas por electroforesis en gel, seguido por la digestión en gel de bandas de proteínas y el análisis de los péptidos mediante espectrometría de masas. A menudo, esto limita el estudio a un pequeño subconjunto de proteínas. Además, los complejos de proteínas están expuestos a la desnaturalización o condiciones no fisiológicas durante el procedimiento. Para evitar estos problemas, hemos puesto en marcha una técnica de gran escala proteómica cuantitativa para extraer datos imparciales y cuantificados. Usamos el etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para incorporar los núcleos de isótopos de primera necesidad en las proteínas de una cepa control sin etiquetar. Volúmenes iguales de la cultura de etiqueta y sin etiqueta, cultura SILAC marcado se mezclan y se lisaron por molienda en nitrógeno líquido. A continuación, llevar a cabo un procedimiento de purificación de la afinidad para tirar hacia abajo los complejos de proteínas. Por último, se precipitan las proteínas de la muestra, que está listo para su análisis por cromatografía líquida de alta resolución / espectrometría de masas en tándem. Más importante aún, las proteínas de la cepa de control están marcados por el isótopo pesado y producirá un cambio de masa / carga que se puede cuantificar en contra de las proteínas sin marcar en la cepa de cebo. Por lo tanto, los contaminantes, o la unión no específica se pueden eliminar fácilmente. Con este enfoque, se han identificado varias proteínas nuevas que se localizan en el ER-PM MCS. Aquí se presenta una descripción detallada de nuestro enfoque.

Protocol

Materiales y Métodos Cepas de levadura Todas las cepas utilizadas en este estudio se basan en el fondo BY4742. La cepa de control SILAC (Mat uno, his3, leu2, ura3, LYS2 y arg4:: G418) se hizo en el apareamiento arg4 supresión cepa (Mat uno, HIS3, URA3, leu2 y arg4:: G418) a BY4742 (Mat alfa, his3, leu2, ura3 y LYS2), y los haploides meiótica se obtuvieron por disección tétrada. Por lo tanto, la tensión de control es una auxótrofo de lisina y arginina. La cep…

Discussion

Las alícuotas guardado durante el procedimiento de purificación que incluyen (1) pre-aprobados lisado celular, (2) fracción unida, (3) fracción libre, y (4) fracción eluida. Le recomendamos analizar el contenido de proteínas de las alícuotas anteriormente por Western Blot utilizando anticuerpos anti-TAP o tinción de plata para reflejar la eficacia vinculante y liberadores del experimento. Ejemplos de un gel de plata de colores y una mancha se muestra en la Figura 1.

Desde SILAC nos p…