Identification des complexes protéiques avec la protéomique quantitative chez S. cerevisiae

Summary

Ici, nous décrivons une nouvelle technique quantitative en protéomique pour identifier les complexes protéiques chez Saccharomyces cerevisiae. Dans cette étude, nous avons utilisé la méthode SILAC avec purification par affinité suivie par spectrométrie de masse en tandem afin d'identifier avec une grande spécificité les partenaires de liaison d'une protéine ER, Scs2p.

Abstract

Les lipides sont les constituants des membranes cellulaires qui fonctionnent comme des barrières et dans le cloisonnement des processus cellulaires, et récemment, aussi importantes molécules de signalisation intracellulaire. Cependant, contrairement aux protéines, les lipides sont des petites molécules hydrophobes que le trafic principalement par les routes mal décrits nonvesicular, qui sont supposé se produire à des sites de contact à membrane (MCS). MCS sont des régions où le réticulum endoplasmique (RE) fait un contact physique direct avec un partenariat organite, par exemple, la membrane plasmique (MP). La portion des ER ER-PM MCS est enrichi en lipides synthétiser des enzymes, ce qui suggère que la synthèse des lipides est dirigé vers ces sites et ce qui implique que MCS sont importantes pour le trafic des lipides. La levure est un modèle idéal pour étudier ER-PM PMRs raison de leur abondance, avec plus de 1000 contacts par cellule, et leur nature préservée chez tous les eucaryotes. Découvrir des protéines qui constituent MCS est essentielle pour comprendre comment le trafic des lipides est accompli dans les cellules, et comment ils agissent comme des molécules de signalisation. Nous avons trouvé que l'ER appelé Scs2p localiser à ER-PM MSSC et est important pour leur formation. Nous nous concentrons sur la découverte des partenaires moléculaires de la Scs2p. Identification des complexes protéiques repose traditionnellement sur la première résolution échantillons protéine purifiée par électrophorèse sur gel, suivie par la digestion dans le gel des bandes de protéines et d'analyse des peptides par spectrométrie de masse. Cette limite souvent l'étude d'un petit nombre de protéines. En outre, les complexes protéiques sont exposés à la dénaturation ou non des conditions physiologiques lors de la procédure. Pour contourner ces problèmes, nous avons mis en œuvre à grande échelle en protéomique technique quantitative d'extraire des données impartiales et quantifiés. Nous utilisons l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC) à intégrer des noyaux d'isotopes de base en protéines dans une souche témoin non balisé. Des volumes égaux de la culture marqués et non marqués, la culture SILAC marqués sont mélangés et lysées par broyage dans l'azote liquide. Nous avons ensuite effectuer une procédure de purification par affinité pour abattre des complexes protéiques. Enfin, nous précipiter l'échantillon de protéine, qui est prêt pour l'analyse par chromatographie liquide à haute performance / spectrométrie de masse en tandem. Surtout, les protéines de la souche de contrôle sont marquées par l'isotope lourd et va produire un changement de masse / charge qui peut être quantifiée contre les protéines non marqué dans la souche d'appât. Par conséquent, les contaminants, ou une liaison non spécifique peut être facilement éliminé. En utilisant cette approche, nous avons identifié de nouvelles protéines de plusieurs qui localisent à l'ER-PM MCS. Nous présentons ici une description détaillée de notre approche.

Protocol

Matériel et méthodes Les souches de levures Toutes les souches utilisées dans cette étude sont basées sur le fond BY4742. La souche de contrôle SILAC (Mat A, his3, leu2, ura3, lys2 et arg4:: G418) a été faite par l'accouplement arg4 souche suppression (Mat A, his3, ura3, leu2, et arg4:: G418) pour BY4742 (Mat alpha, his3, leu2, ura3 et lys2), et les haploïdes méiotique ont été obtenus par dissection tétrade. Par conséquent, la souche de contrôle …

Discussion

Les aliquotes enregistrées au cours de la procédure de purification doit inclure (1) lysat de cellules pré-autorisé, (2) fraction liée, fraction libre (3), et (4) fraction éluée. Nous vous recommandons d'analyser les teneurs en protéines des aliquotes ci-dessus par Western blot utilisant des anticorps anti-anticorps ou TAP coloration à l'argent afin de refléter l'efficacité de fixation et d'élution de l'expérience. Exemples d'un gel coloré à l'argent et une tache sont présent?…