鉴定与定量蛋白质组学在酿酒酵母中的蛋白质复合物

Summary

在这里，我们描述了一个新的量化确定在酿酒酵母中的蛋白质复合物的蛋白质组学技术。在这项研究中，我们一起串联质谱法，具有高特异性识别ER蛋白，Scs2p的具有约束力的合作伙伴的亲和纯化使用的SILAC方法。

Abstract

血脂，细胞膜功能的细胞过程中条块分割的壁垒和积木，最近，作为重要的细胞内信号分子。然而，与蛋白质，脂类是小的疏水性分子的交通主要是由不良描述nonvesicular路线，这是假设发生在膜接触点（MCSS）。热对流是内质网（ER）与一个合作伙伴的细胞器，如细胞膜（下午）直接的身体接触的地区。丰富脂质合成酶的ER – PM的热对流的ER部分，这表明，脂质合成是针对这些网站和暗示的MCS是重要的脂质交通。酵母是一种理想的模型来研究ER – PM的，因为它的丰富的MCS与超过1000个联系人，每个细胞中，和他们在所有真核生物中保守性，。发现的蛋白质构成的MCS是至关重要的理解血脂交通是如何在细胞内完成，以及它们如何作为信号分子的行为。我们发现，所谓的Scs2p一个ER本地化ER – PM的MCS，其形成的重要。我们专注于揭露Scs2p分子伙伴。鉴定蛋白质复合物的传统依赖于首​​先解决凝胶电泳凝胶的蛋白条带的消化和分析肽质谱，纯化的蛋白质样品。这往往限制了研究的蛋白质的一小部分。此外，蛋白质复合物的暴露变性或在手术过程中的非生理条件。为了规避这些问题，我们已实施了大规模的定量蛋白质组学技术提取公正和量化的数据。我们用稳定同位素标记氨基酸在细胞培养（SILAC）纳入蛋白质在无标记的控制应变主食同位素原子核。标签的文化和无标记的，SILAC标记的文化等量混合在一起，并在液氮研磨溶解。然后，我们开展的亲和纯化过程拉下蛋白质复合物。最后，我们沉淀的蛋白质样品，这是准备通过高性能的液相色谱/串联质谱分析。最重要的是，在控制菌株的蛋白质是由重同位素标记会产生一个质量/充电的转变，可对未标注蛋白质量化诱饵应变。因此，污染物，或者非特异性结合，可以很容易地消除。通过使用这种方法，我们已经确定了一些新的蛋白质，定位于ER – PM的MCS。在这里，我们提出了我们的方法的详细描述。

Protocol

材料和方法酵母菌株在这项研究中使用的所有菌株的基础上BY4742背景。 SILAC控制应变（ 垫的，HIS3，LEU2，URA3，lys2和arg4：G418）是由交配arg4缺失株（ 垫，HIS3，URA3，LEU2，和arg4：G418）BY4742（垫阿尔法， HIS3，LEU2，URA3和lys2），减数分裂单倍体获得四分体夹层。因此，控制应变是赖氨酸和精氨酸营养缺陷型。使用矢量pBS1479 PCR介导的同源重组诱饵应变。因此，在这项?…

Discussion

在纯化过程中保存的等分应包括：（1）事先批准的细胞裂解液，（2）约束的一小部分，（3）不作承诺的一小部分，以及（4）洗脱组分。我们建议由西方上述等份分析的蛋白质含量，杂交使用抗TAP抗体或银染色，以反映实验的约束力和洗脱效率。一个银染凝胶和印迹的例子，如图1所示。

由于SILAC我们提供公正和量化的测量与蛋白结合的合作伙伴，我们只能做的TAP纯化的第一?…