זיהוי של קומפלקסים חלבונים עם proteomics כמותיים cerevisiae ס
Summary
כאן אנו מתארים טכניקה חדשה proteomics כמותיים לזיהוי מתחמי חלבון cerevisiae Saccharomyces. במחקר הנוכחי, השתמשנו בשיטה SILAC יחד עם טיהור זיקה ואחריו טנדם ספקטרומטריית מסה להזדהות עם סגוליות גבוהה השותפים המחייב של חלבון ER, Scs2p.
Abstract
ליפידים הם אבני הבניין של ממברנות הסלולר המתפקדים מחסומים ועל מידור של תהליכים תאיים, ולאחרונה, כפי חשוב מולקולות איתות תאיים. עם זאת, בניגוד חלבונים, שומנים הם מולקולות הידרופוביות קטנות תעבורה בעיקר על ידי נתיבי nonvesicular תיאר גרוע, שהם שיערו להתרחש בכל מגע אתרים קרום (MCSs). MCSs הם אזורים שבהם reticulum endoplasmic (ER) עושה מגע פיזי ישיר עם אברון משתפת פעולה, למשל, פלזמה הממברנה (PM). החלק המיון של ER-PM MCSs הוא מועשר ב שומנים לסנתז אנזימים, טוען כי סינתזה השומנים מופנית לאותם אתרים רומז כי MCSs חשובים תנועה השומנים. שמרים הוא מודל אידיאלי ללמוד ER-PM MCSs בגלל השפע שלהם, עם למעלה מ 1000 אנשי קשר לכל תא, טבע נשמרת שלהם כל אאוקריוטים. חשיפת חלבונים המהווים MCSs הוא קריטי כדי להבין כיצד תנועה שומנים נעשית בתאים, וכיצד הם פועלים כמו מולקולות איתות. מצאנו כי ER נקרא Scs2p למקם את ER-PM ו MCSs חשוב היווצרותם. אנו מתמקדים בחשיפת השותפים המולקולרי של Scs2p. זיהוי של קומפלקסים חלבונים מסורתי מסתמך על הראשון לפתרון דגימות חלבון מטוהרים על ידי ג'ל אלקטרופורזה, ואחריו עיכול ג'ל של להקות החלבון ואנליזה של פפטידים על ידי ספקטרומטריית מסה. זה לעתים קרובות מגביל את לימוד בקבוצה קטנה של חלבונים. כמו כן, קומפלקסים חלבונים נחשפים denaturing או לא תנאים פיזיולוגיים במהלך ההליך. כדי לעקוף את הבעיות הללו, יישמנו בקנה מידה גדול טכניקה proteomics כמותיים כדי לחלץ נתונים משוחדת לכמת. אנו משתמשים תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) לשלב גרעינים איזוטופ מצרך חלבונים זן פקד לא מתוייגת. כמויות שוות של התרבות מתויג לא מתוייגת, תרבות SILAC שכותרתו מעורבבים יחד lysed על ידי שחיקה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, אנו לבצע הליך טיהור זיקה לנתץ קומפלקסים חלבונים. לבסוף, אנו לזרז את המדגם חלבון, שהוא מוכן לניתוח על ידי כרומטוגרפיה ביצועים גבוהים נוזלי / ספקטרומטריית מסה טנדם. והחשוב מכל, חלבונים זן הבקרה מסומנים על ידי האיזוטופ הכבד יהיה לייצר שינוי מסה / מטען, כי ניתן לכמת נגד חלבונים ללא תווית בזן את הפיתיון. לכן, מזהמים, או מחייב נוקבים ניתן לבטל בקלות. על ידי שימוש בגישה זו, זיהינו חלבונים הרומן מספר למקם את ER-PM MCSs. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הגישה שלנו.
Protocol
Discussion
Aliquots הציל במהלך ההליך טיהור צריכה לכלול (1) מראש פינה lysate התא, (2) חלק מחויב, (3) חלק מאוגד, ו (4) חלק eluted. אנו ממליצים על ניתוח תוכן של חלבון aliquots לעיל על ידי המערב סופג באמצעות נוגדן אנטי מכתים TAP או כסף כדי לשקף את היעילות מחייב משחררי הניסוי. דוגמאות של ג'ל מוכתם כסף כתם מ?…
References
- Loewen, C. J. Inheritance of cortical ER in yeast is required for normal septin organization. Jour. Cell Biol. 179, 467-483 .
- Ong, S., Foster, L. J., Hoog, C. L., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 .
- Puig, O. The Tandem Affinity Purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 .
- Amberg, D. C., Burke, D. J., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics. , 123-125 .
