Identifizierung von Protein-Komplexen mit der quantitativen Proteomik in S. cerevisiae

Summary

Hier beschreiben wir eine neue quantitative Proteomik Verfahren zur Identifizierung von Protein-Komplexen in Saccharomyces cerevisiae. In dieser Studie haben wir die SILAC-Methode zusammen mit Affinitätsreinigung durch Tandem-Massenspektrometrie gefolgt, um mit hoher Spezifität zu identifizieren die Bindungspartner einer ER-Protein, Scs2p verwendet.

Abstract

Lipide sind die Bausteine ​​der Zellmembranen, die als Barrieren und in Abschottung von zellulären Prozessen, und vor kurzem, wie wichtig intrazellulären Signalmolekülen. Doch im Gegensatz zu Proteinen, Lipiden sind kleine hydrophobe Moleküle, dass der Verkehr vor allem durch schlecht beschrieben nonvesicular Routen, die die Hypothese aufgestellt, um an der Membran Kontaktstellen (MCS) auftreten. MCSs sind Regionen, in denen das endoplasmatische Retikulum (ER) ermöglicht den direkten körperlichen Kontakt mit einem Partner Organellen, zB Plasmamembran (PM). Die ER Teil des ER-PM MCSs ist in lipid-synthetisierenden Enzyme angereichert, was darauf hindeutet, dass Lipid-Synthese zu diesen Seiten gerichtet ist und was impliziert, dass MCSs wichtig sind für die Lipid-Verkehr. Hefe ist ein ideales Modell, um ER-PM MCSs wegen ihrer Fülle Studie mit über 1000 Kontakten pro Zelle, und ihre konservierte Natur in allen Eukaryoten. Das Aufdecken der Proteine, die MCSs bilden ist entscheidend für das Verständnis, wie Lipide Verkehr in Zellen erreicht wird, und wie sie wirken als Signalmoleküle. Wir haben festgestellt, dass ein ER genannt Scs2p zu ER-PM MCSs lokalisieren und ist für ihre Bildung wichtig. Wir sind auf die Aufdeckung der molekularen Partner Scs2p konzentriert. Identifizierung von Protein-Komplexen beruht traditionell auf der ersten Lösung gereinigtes Protein-Proben mittels Gelelektrophorese, durch In-Gel-Verdauung von Eiweiß Bands und Analyse von Peptiden durch Massenspektrometrie verfolgt. Diese oft Grenzen der Studie auf eine kleine Teilmenge von Proteinen. Außerdem werden Protein-Komplexe zu denaturieren oder nicht-physiologischen Bedingungen während des Verfahrens ausgesetzt. Um diese Probleme zu umgehen, haben wir eine groß angelegte quantitative Proteomics-Technik für eine objektive und quantifizierte Daten zu extrahieren umgesetzt. Wir verwenden stabile Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in der Zellkultur (SILAC) zu heften Isotop Kerne in Proteine ​​einzubauen in einem untagged Kontrollstamm. Gleiche Volumina getaggt Kultur und untagged, SILAC-markierten Kultur miteinander vermischt und lysiert durch Schleifen in flüssigem Stickstoff. Wir führen dann eine Affinität Reinigungsverfahren nach unten ziehen, Protein-Komplexen. Schließlich Niederschlag wir die Proteinprobe, die bereit sind für die Analyse durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie / Tandem-Massenspektrometrie ist. Am wichtigsten ist, sind Proteine ​​in der Kontrolle Belastung durch das schwere Isotop markiert und wird eine Masse / Ladungs-Verschiebung, die gegen die unmarkierte Proteine ​​in den Köder Belastung quantifiziert werden können, zu produzieren. Daher können Verunreinigungen oder unspezifische Bindung leicht beseitigt werden. Durch diesen Ansatz haben wir mehrere neue Proteine, die ER-MCSs PM lokalisieren identifiziert. Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung unseres Ansatzes.

Protocol

Material und Methoden Hefestämme Alle Stämme in dieser Studie basieren auf der BY4742 Hintergrund. Der SILAC Kontrollstamm (Mat a, his3, leu2, ura3, lys2 und arg4: G418): bis BY4742 (Mat alpha wurde durch Paarung arg4 Löschung Stamm (: G418 Mat a, HIS3, URA3, LEU2 und arg4) gemacht his3, leu2, ura3 und lys2) und der meiotischen Haploiden wurden von Tetrade Dissektion erhalten. Daher ist die Kontrolle Stamm eine auxotroph für Lysin und Arginin. Der Köd…

Discussion

Die Aliquots während der Reinigungsprozedur gespeichert werden sollen umfassen (1) mit bereits geklärten Zelllysat, (2) gebundenen Fraktion (3), ungebundene Fraktion, und (4) eluierte Fraktion. Wir empfehlen die Analyse der Protein Inhalt der oben Aliquots durch Western-Blot mit anti-TAP-Antikörper oder Silberfärbung, die Bindung und Elution Effizienz des Experiments zu reflektieren. Beispiele für eine mit Silber gefärbten Gel und ein Schandfleck sind in Abbildung 1 dargestellt.

Da SIL…