TL-etikettering van Drosophila Hart Structuren
Summary
Hier beschrijven we een basisprotocol voor TL-etikettering van de verschillende elementen van het hart buizen van larven en volwassen<em> Drosophila melanogaster</em>. Deze exemplaren zijn zeer geschikt voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Deze techniek maakt gedetailleerde structurele analyse van de kenmerken van de harten van een krachtig model organisme.
Abstract
De<em> Drosophila melanogaster</em> Dorsale vat, of hart, is een buisvormige structuur bestaat uit een enkele laag van contractiele cardiomyocyten, pericardiale cellen die lijn langs elke kant van de hartwand, ondersteunende Alary spieren en, bij volwassenen, een laag van ventrale longitudinale spiercellen. De contractiele vezels huis bewaarde onderdelen van de spier cytoarchitecture ook dicht op elkaar gepakte bundels van myofibrillen en het cytoskelet / submembranous eiwitcomplexen, die interageren met homologe componenten van de extracellulaire matrix. Hier beschrijven we een protocol voor de fixatie en de fluorescerende etikettering van bepaalde myocard elementen uit de harten van ontleed larven en semi-intacte volwassen<em> Drosophila</em>. In het bijzonder tonen we de etikettering van sarcomeer F-actine en van α-actinine in larvale harten. Daarnaast voeren we de etikettering van F-actine en α-actinine in myosine-GFP expressie volwassen vliegen en van α-actinine en pericardin, een type IV extracellulaire matrix van collageen, in het wild type volwassen harten. Bijzondere aandacht wordt gegeven aan een montage van de strategie voor de semi-intacte volwassen harten dat de behandeling minimaliseert en optimaliseert de mogelijkheden voor het behoud van de integriteit van de hart-buizen en de omliggende weefsels. Deze preparaten zijn geschikt voor de beeldvorming via fluorescentie en confocale microscopie. Het geheel genomen, deze procedure zorgt voor een zorgvuldige en gedetailleerde analyse van de structurele kenmerken van het hart van een krachtige genetisch soepel model systeem.
Protocol
Discussion
Hier presenteren wij een protocol nuttig voor het opstellen en kleuren van de Drosophila melanogaster dorsale vat en de omliggende weefsels voor imaging via fluorescentie of confocale microscopie. Wij bieden een beknopt verslag van de stappen verfijnd door en algemeen gebruikt in ons lab voor effectieve kleuren die goed opgelost vergunningen in situ beeldvorming van larven en volwassen Drosophila hart buizen. Anderen hebben soortgelijke methoden beschreven in verkorte vorm 2, 3, 4. …
Acknowledgements
De auteurs danken SI Bernstein (San Diego State University) voor het kritisch lezen en nuttige suggesties met betrekking tot de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door NIH beurzen aan SI Bernstein, SDSU, en R. Bodmer, BIMR en door een post-doctorale beurs uit de Westerse staten Partner van de American Heart Association aan G. Vogler en A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. . The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
