Etichette fluorescenti di Drosophila Cuore Strutture
Summary
Qui si descrive un protocollo di base per la marcatura fluorescente di elementi diversi di tubi cuore da larve e adulti<em> Drosophila melanogaster</em>. Questi esemplari sono particolarmente adatti per l'imaging mediante microscopia a fluorescenza o confocale. Questa tecnica permette una dettagliata analisi strutturale delle caratteristiche del cuore di un organismo modello potente.
Abstract
Il<em> Drosophila melanogaster</em> Vaso dorsale, o cuore, è una struttura tubolare costituito da un singolo strato contrattile dei cardiomiociti, le cellule del pericardio che si allineano lungo ogni lato del muro di cuore, i muscoli Alary di supporto e, negli adulti, uno strato di cellule muscolari longitudinale ventrale. La casa contrattile delle fibre conservato componenti del citoarchitettura tra fasci muscolari densamente delle miofibrille e dei complessi di proteine del citoscheletro / submembranous, che interagiscono con omologhe componenti della matrice extracellulare. Qui si descrive un protocollo per la fissazione e la marcatura fluorescente di particolari elementi del miocardio dal cuore delle larve sezionato e semi-intatte adulti<em> Drosophila</em>. In particolare, abbiamo dimostrato l'etichettatura dei sarcomerica F-actina e di α-actinina nei cuori larvale. Inoltre, noi dobbiamo fare l'etichettatura di F-α-actina e miosina in actinina-GFP che esprimono le mosche adulte e di α-actinina e pericardin, una matrice di collagene di tipo IV extracellulare, nel cuore selvaggio di tipo adulto. Particolare attenzione viene data a una strategia di montaggio per semi-intatti i cuori degli adulti che riduce al minimo la manipolazione ed ottimizza la possibilità di mantenere l'integrità dei tubi e dei tessuti cardiaci associati. Questi preparati sono adatti per l'imaging tramite microscopia a fluorescenza e confocale. In generale, questa procedura consente di analisi attenta e dettagliata delle caratteristiche strutturali del cuore da un potente sistema geneticamente modello trattabili.
Protocol
Discussion
Qui vi presentiamo un protocollo utile per la preparazione e la colorazione dorsale Drosophila melanogaster nave e dei relativi tessuti per l'imaging tramite microscopia a fluorescenza o confocale. Forniamo un resoconto sintetico dei passi da raffinate e comunemente impiegati nel nostro laboratorio per la colorazione efficace che permette ben risolta nella diagnostica per immagini in situ di larve e adulti tubi cuore Drosophila. Altri hanno descritto metodi simili in forma abbrevi…
Acknowledgements
Gli autori ringraziano SI Bernstein (San Diego State University) per la lettura critica e utili suggerimenti per quanto riguarda la preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni di NIH SI Bernstein, SDSU, e di R. Bodmer, BIMR, e da un post-dottorato dal Affiliato occidentale Stati della American Heart Association a G. Vogler e ad A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
References
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