في الجسم الحي مثل الفئران عضوي النمط الثقافة Wholemount الشبكية
Summary
هذه المقالة يوضح الفيديو إنشاء الثقافات عضوي النمط wholemount شبكية العين وإجراء cytospin لتحليل الآثار الناجمة خارجيا. عضوي النمط الثقافات wholemount الشبكية تقليد<em> في الجسم الحي</em> الوضع بشكل كبير وتسهيل إمكانية الوصول إلى شبكية العين الفئران عن التلاعب التجريبية الوقت الذي يحاصر فيه عيوب الكلاسيكية الفئران النماذج الحيوانية.
Abstract
ablations استهداف الجينات وتحليل النماذج الحيوانية هي استراتيجية محددة للالتحاق الكلاسيكية وظائف الجينات الشبكية. ومع ذلك ، وراثيا ، شبكية محددة أو مشروطة عرض نماذج الماوس خروج المغلوب غالبا الفتك المبكر أو شديدة يعانون من تشوهات ، ومنع تحليل يتجاوز المراحل الجنينية أو بعد الولادة المبكرة.
زراعة الخلايا الأولية هي بديل للتحقيق في آثار العوامل خارجيا المؤتلف التطبيقية ، overexpression من الجينات أو ضربة قاضية سيرنا بوساطة الجينات في بيئة تسيطر عليها. فصل الثقافة الخلية لديه ميزة أن يتم تخفيض الإشارات الذاتية الوصول إلى الخلايا المستهدفة ، مما يسهل التعرف على الآثار الناجمة خارجيا بعد التلاعب الدوائية. ومع ذلك ، يتم تدمير الخلية في البداية مهمة خلية التفاعلات الأنزيمية التي هضم أو ميكانيكية التفكك ، حتى إذا تم استخدام إعادة تجميعها الثقافات retinospheroid 1.
على النقيض من ذلك ، عضوي النمط الثقافات wholemount الشبكية توفير نظام قريب من الفسيولوجية في الجسم الحي مع الحالة العصبية والتفاعلات اتصالات 2-5 لا تزال محفوظة.
في هذه المقالة الفيديو نقدم خطوة خطوة من خلال مظاهرة للمؤسسة (1) من الجسم الحي في مثل الثقافات عضوي النمط wholemount الشبكية بما فيها خصوصيات تشريح الفئران الجنينية العينين ، والكبار وبعدها (2) إجراء تفارق وcytospin لتحليل الخلايا العصبية موت الخلايا المبرمج وتكاثر الخلايا في شبكية العين wholemounts عضوي النمط ، على سبيل المثال بعد الثقافة في وجود عوامل خارجيا المؤتلف التطبيقية.
Protocol
Discussion
ميزة عضوي النمط شبكية الفئران 2-5 الثقافات wholemount أكثر من التفكك ، أحادي الطبقة ، أو إعادة تجميعها retinospheroid – 3D الثقافات كروي 1 يكمن في الحفاظ على التفاعلات العصبية واتصالات ، محاكاة الوضع في الجسم الحي. بالمقارنة مع التقارير السابقة 2 ، مقالتنا الف…
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر E. دي لا روسا وفالنسيانو منظمة العفو الدولية للمساعدة أولية مع إنشاء الثقافات وعضوي النمط U. لوب وGerster U. للمساعدة التقنية.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
