生体のような器官型マウス網膜Wholemountの文化で
Summary
このビデオの記事では、器官型網膜wholemount文化や外因性誘導効果の分析のためのサイトスピン手順の確立を示しています。器官型網膜wholemount文化模倣体<em> in vivoで</em>状況と古典的なマウスの動物モデルの欠点を回避しながら大幅に実験操作のためのマウス網膜のアクセシビリティを促進する。
Abstract
動物モデルの遺伝子と分析の対象とアブレーションは、入学する特定の網膜遺伝子機能のための古典的な戦略です。しかしながら、トランスジェニックは、網膜特異的またはコンディショナルノックアウトマウスモデルは、しばしば早期致死を表示したり、胎児や出生後早期の段階を超えて解析を防止する、深刻な奇形に苦しんでいます。
初代培養細胞は、外因的に適用される組換え因子、制御された環境での遺伝子やsiRNAによる遺伝子ノックダウンの過剰発現の影響を調べるための代替です。解離細胞の培養は、それによって薬理学的操作の後に外生的にトリガーの効果の識別を容易に、標的細胞に到達する内因性信号が低下するという利点があります。しかし、重要な細胞間相互作用は、最初に再集計されたretinospheroid文化1が使用されている場合でも、酵素消化または機械的な解離によって破壊されています。
これとは対照的に、器官型網膜wholemount文化が神経細胞の相互作用との接続はまだ保持さ2〜5で生体状況に近い生理的にシステムを提供しています。
このビデオの記事では、胚、生後および成体マウスの目の解剖の特殊性と神経の分析のため（2）解離とサイトスピン手順を含む器官網膜wholemountの文化のようなin vivoでの（1）設立のステップのデモンストレーションでステップを提供するアポトーシスと外因的に適用される組換え因子の存在下で培養した後、例えば器官wholemountsにおける網膜細胞の増殖、。
Protocol
Discussion
解離、単分子層以上のマウス器官網膜wholemount文化2-5、retinospheroidまたは再集計された3D回転楕円体の培養神経細胞の相互作用との接続の保全1嘘、の利点は 、in vivo の状況で模倣した。旧レポート2〜比較して、私たちのビデオの記事では、網膜を損傷することなく、マウスの目とレンズと硝子体の除去を含む、さまざまな発育段階の網膜の解剖摘出…
Acknowledgements
著者は、技術支援のための器官培養およびU. LaubとU.ゲルスターの設立と初期支援のためにE.デラロサとAI Valencianoに感謝します。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
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