In vivo, come organotipica Cultura Murine Wholemount retina
Summary
In questo articolo video dimostra la creazione di organotipica culture retina wholemount cytospin e una procedura per l'analisi di esogenamente effetti indotti. Organotipica culture retina wholemount imitare il<em> In vivo</em> Situazione e favorire in modo significativo l'accessibilità di retina murini per le manipolazioni sperimentali che aggirano gli svantaggi dei classici modelli animali murini.
Abstract
Ablazioni mirata di geni e l'analisi di modelli animali è la strategia classica per la funzione dell'iscrizione gene specifico della retina. Tuttavia, transgenici, retina specifici o condizionale modelli di topo knockout spesso mostrano mortalità precoce o soffre di malformazioni gravi, impedendo l'analisi al di là fasi embrionali o postnatale precoce.
Colture di cellule primarie è un'alternativa per studiare gli effetti di fattori applicata ricombinante esogena, l'iperespressione di geni o di siRNA-mediato knockdown gene in un ambiente controllato. Colture di cellule dissociate ha il vantaggio che i segnali endogeni raggiungere le cellule bersaglio sono ridotte, facilitando l'identificazione di effetti esogenamente attivato dopo manipolazione farmacologica. Tuttavia, importanti interazioni cellula-cellula sono inizialmente distrutte per digestione enzimatica o dissociazione meccanica, anche se le culture retinospheroid riaggregati 1 sono utilizzati.
Al contrario, organotipica culture retina wholemount fornire un sistema vicino al fisiologico de situazione vivo con le interazioni e le connessioni neuronali 2-5 ancora conservati.
In questo articolo abbiamo video di fornire una dimostrazione passo passo (1) l'istituzione di in vivo, come organotipica culture wholemount della retina, comprese particolarità dissezione degli occhi murini embrionale, postnatale e adulta e (2) una procedura di dissociazione e cytospin per l'analisi dei neuroni apoptosi e la proliferazione delle cellule della retina in wholemounts organotipica, ad esempio dopo coltura in presenza di fattori esogeni applicata ricombinante.
Protocol
Discussion
Il vantaggio di murine organotipica retina 2-5 wholemount culture più di dissociazione, monostrato, culture 3D retinospheroid o ri-aggregati sferoidali 1 risiede nella conservazione delle interazioni e connessioni neuronali, imitando la situazione in vivo. Rispetto ai rapporti precedenti 2, il nostro articolo video fornisce una dimostrazione dettagliata delle peculiarità di enucleazione degli occhi murini e la dissezione di retine di varie fasi di sviluppo tra cui la rimozione…
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare E. de la Rosa e AI Valenciano di aiuto iniziale con l'istituzione delle culture organotipica e U. Laub e U. Gerster per l'assistenza tecnica.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
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- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
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