En vivo-como organotípicos Cultura murino wholemount retina

Summary

Este artículo video demuestra el establecimiento de cultivos de retina organotípicos wholemount y un procedimiento citospina para el análisis de los efectos inducidos exógenamente. Organotípicos culturas wholemount imitar la retina<em> In vivo</em> Situación y facilitan significativamente la accesibilidad de las retinas murino de manipulaciones experimentales eludiendo las desventajas de los clásicos modelos animales murinos.

Abstract

Ablaciones específica de genes y el análisis de modelos animales es la estrategia clásica para inscribir a la función de genes específicos de retina. Sin embargo, transgénicos, modelos knockout específicos retina-o condicional del ratón a menudo muestran letalidad temprana o sufren de malformaciones severas, impidiendo un análisis más allá de las etapas embrionarias o postnatal temprano.

Cultivo de células primarias es una alternativa para investigar los efectos de la aplicación exógena de factores recombinantes, la sobreexpresión de los genes o siRNA mediada por caída de genes en un ambiente controlado. Cultivo de células disociadas tiene la ventaja de que las señales endógenas alcanzar las células diana se reducen, lo que facilita la identificación de forma exógena efectos activados después de la manipulación farmacológica. Sin embargo, importantes interacciones célula-célula son inicialmente destruidas por digestión enzimática o la disociación mecánica, aunque reagrupadas culturas retinospheroid ¹ se utilizan.

Por el contrario, las culturas organotípicos wholemount retina proporcionar un sistema de cerca las necesidades fisiológicas en la situación in vivo de interacciones neuronales y las conexiones de ^5.2 aún se conservan.

En este artículo ofrecemos un vídeo paso a paso la demostración de (1) el establecimiento de in-vivo como organotípicos culturas retina wholemount incluyendo las peculiaridades de los ojos de la disección de embriones murinos, postnatal y adulto, y (2) un procedimiento de disociación y citospina para el análisis de las neuronas la apoptosis y la proliferación de las células de la retina en wholemounts organotípicos, por ejemplo, después de la cultura en la presencia de factores exógenos aplicados recombinante.

Protocol

Todos los equipos y reactivos para comprar estéril o tiene que ser calor o vapor esterilizado o esterilizado con EtOH al 70%. Los autores afirman que los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las Comunidades Europeas la Directiva del Consejo (86/609/CEE), siguiendo las directrices de los NIH sobre el cuidado y uso de animales en los procedimientos experimentales y los reglamentos establecidos por el Comité Institucional la atención y el empleo Comisión (IACUC) de la Univ…

Discussion

La ventaja de ^2-5 murino organotípicos retina culturas wholemount sobre la disociación, monocapa, retinospheroid o volver a agregar las culturas 3D esferoide ^{1 se} encuentra en la preservación de las interacciones neuronales y las conexiones, imitando la situación in vivo. En comparación con informes anteriores ^2, nuestro artículo de vídeo ofrece una demostración detallada de las peculiaridades de la enucleación de ojos murino y la disección de las retinas de l…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Mice	Animal	Charles Rivers Laboratories
Dissection microscope	Tool	ZEISS
PBS	Reagent	Sigma		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham	Reagent	Sigma	D 8900	DMEM / F-12
Apo-transferin	Reagent	Sigma	T 1147
Putrescin	Reagent	Sigma	P 5780
Sodium selenite	Reagent	Sigma	S 9133
Progesterone	Reagent	Sigma	P 6149
Gentamicine	Reagent	Invitrogen
L-Glutamine	Reagent	Invitrogen	25030-024	200 mM (100X), liquid
Bovine serum albumine (BSA)	Reagent	Roth	8076.3	30 mg/ml
Collagenase	Reagent	Sigma	C 0773	200 U/ml
Trypsin	Reagent	Sigma	T4799	From porcine pancreas; 1 mg/ml
Hyaluronidase	Reagent	Sigma	H 3884	200 mg/ml
DNase I	Reagent	Roche	1 284 932	10 mg/ml
EDTA	Reagent	Sigma	E 6511
Silicone solution	Reagent	Serva	35130
Paraformaldehyde (PFA)	Reagent	Sigma	P6148	8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4).
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride	Reagent	Sigma	D 0542	DAPI
Fluorescent Mounting Medium	Reagent	Dako	S3023
BrDU	Reagent	Sigma	B 9285
96-well plates	Tool	FALCON	3072
24-well plates	Tool	FALCON	3047
Pasteur pipettes	Tool	Brand	747720
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors,straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin
Cooling centrifuge	Tool	Eppendorf
Rotation shaker	Tool	CAT
Cytospin	Tool	Thermo Scientific