בשנת vivo, כמו תרבות Wholemount Murine Organotypic רשתית
Summary
מאמר זה מדגים וידאו הקמת organotypic תרבויות wholemount הרשתית הליך cytospin לניתוח תופעות המושרה exogenously. Organotypic תרבויות wholemount רשתית לחקות את<em> In vivo</em> המצב להקל באופן משמעותי את הנגישות של הרשתית Murine עבור מניפולציות ניסיוני תוך עקיפת והחסרונות של קלאסית במודלים של בעלי חיים Murine.
Abstract
כריתה ממוקדת של גנים ואנליזה של מודלים של בעלי חיים היא האסטרטגיה הקלאסית עבור להרשם ספציפיים פונקציה גן הרשתית. עם זאת, מהונדס, הרשתית ספציפי או מותנה עכבר מודלים בנוקאאוט לעתים קרובות להציג הקטלניות מוקדם או סובלים ממומים קשים, מניעת ניתוח מעבר בשלבים עובריים או לאחר לידה מוקדמת.
תרבית תאים ראשונית מהווה חלופה כדי לחקור את ההשפעות של גורמים exogenously רקומביננטי מיושם, overexpression של גנים או siRNA בתיווך מציאה גן בסביבה מבוקרת. תרבית תאים ניתק יש את היתרון כי אותות אנדוגני להגיע לתאי היעד מופחתים, ובכך להקל על זיהוי תופעות מופעלות exogenously לאחר מניפולציה תרופתי. עם זאת, חשוב תאים תאים אינטראקציות נהרסים בתחילה על ידי עיכול אנזימטי או ניתוק מכני, גם אם מחדש מצטברים תרבויות retinospheroid 1 משמשים.
לעומת זאת, organotypic תרבויות wholemount רשתית לספק מערכת קרוב פיזיולוגיים במצב vivo עם אינטראקציות קשרים עצביים 2-5 נשמר עדיין.
במאמר זה אנו מספקים וידאו צעד אחר צעד הפגנה של הממסד (1) in vivo של דמוי organotypic תרבויות wholemount ברשתית כולל מוזרויות דיסקציה של העיניים Murine עובריים, לאחר הלידה למבוגרים ו (2) הליך התנתקות cytospin לניתוח של נוירונים אפופטוזיס ובחלוקה של תאים ברשתית ב wholemounts organotypic, למשל אחרי התרבות בנוכחות exogenously גורמים רקומביננטי מיושם.
Protocol
Discussion
היתרון של 2-5 תרבויות Murine רשתית organotypic wholemount על דיסוציאציה, monolayer, retinospheroid או מחדש מצטברים תרבויות spheroid 3D 1 טמון בשימור אינטראקציות קשרים עצביים, מחקה את המצב vivo. לשם השוואה דיווחים 2 לשעבר, במאמר וידאו שלנו מספק הדגמה מפורטת של מוזרויות ב enucleation…
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות E. דה לה רוזה ו-AI Valenciano לעזרה ראשונית עם הקמתה של התרבויות organotypic ו ע ו U. לאוב Gerster לקבלת סיוע טכני.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
- Rieke, M., Gottwald, E., Weibezahn, K. -. F., Layer, P. G. Tissue reconstruction in 3D-spheroids from rodent retina in a motion-free, bioreactor-based microstructure. Lab. Chip. 8, 2006-2213 (2008).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nature Protocols. 1, 2710-2718 (2006).
- Duenker, N., Valenciano, A. I., Franke, A., Hernandez-Sanchez, C., Dressel, R., Behrendt, M., de Pablo, F., Krieglstein, K., de la Rosa, E. J. Balance of pro-apoptotic transforming growth factor-beta and anti-apoptotic insulin effects in the control of cell death in the postnatal mouse retina. Eur. J. Neurosci. 22, 28-38 (2005).
- Franke, A. G., Gubbe, C., Beier, M., Duenker, N. Transforming growth factors beta and Bone morphogenetic proteins: Cooperative players in chick and murine programmed retinal cell death. J. Comp. Neurol. 495, 263-278 (2005).
- de la Rosa, E. J., Díaz, B., De Pablo, F. Organoculture of the chick embryonic neuroretina. Curr. Top. Dev. Biol. 36, 133-144 (1998).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Duenker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: How it really works. J Vis Exp. 32, (2009).
