에서 Organotypic Murine 망막 Wholemount 문화 생체내 같은
Summary
이 동영상이 문서에서는 organotypic 망막 wholemount 문화와 exogenously 유발 효과 분석을 위해 cytospin 절차의 설립을 보여줍니다. Organotypic 망막 wholemount 문화를 모방<em> 생체내에</em> 상황과 고전 murine 동물 모델의 단점을 우회하면서 상당히 실험적인 조작을위한 murine 망막의 접근을 용이하게합니다.
Abstract
동물 모델의 유전자 분석 타겟팅 ablations는 등록 망막 특정 유전자 기능에 대한 전통적인 전략이다. 그러나, 유전자 변형은 망막 특정 또는 조건부 녹아웃 마우스 모델은 종종 초기 파괴 장면을 보여 주죠를 표시하거나 배아 또는 출생 후의 초기 단계 이상의 분석을 방지 심한 기형으로 고통.
기본 세포 배양은 exogenously 적용 재조합 요인, 제한된 환경에서 유전자 또는 siRNA – 중재 유전자 최저의 overexpression의 효과를 조사하기 위해 대안입니다. Dissociated 세포 배양하므로 약리 조작 후 exogenously 발생 효과의 신분을 촉진, 대상 세포에 도달하는 내생 신호가 감소되는 장점이 있습니다. 그러나, 중요한 세포 – 세포 상호 작용은 초기에 다시 집계 retinospheroid 문화 하나를 사용하더라도, 효소 소화 또는 기계적 분리에 의해 파괴됩니다.
반대로, organotypic 망막 wholemount 문화의 연결 상호 작용 및 연결을 아직도 보존되어 2-5로 생체내 상황에 가까운 생리하는 시스템을 제공합니다.
이 동영상이 문서에서 우리는 배아, 출생 후의 성인 murine 눈 해부의 특성과의 연결을 분석 (2) 분리 및 cytospin 절차를 포함 organotypic 망막 wholemount 문화와 같은 생체내에서 (1) 설립의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다 apoptosis와 organotypic wholemounts에서 망막 세포 증식은 exogenously 적용 재조합 요인의 존재의 문화 후 예.
Protocol
Discussion
분리, monolayer 이상 murine organotypic 망막 wholemount 문화 2-5, retinospheroid하거나 다시 집계 3D 회전 타원체 문화의 연결 상호 작용 및 연결의 보존 1 거짓의 장점은 생체내 상황에을 흉내낸. 이전 보고서 2 비교, 우리의 비디오 문서는 망막을 손상시키지 않고 렌즈와 유리 신체의 제거를 포함하여 다양한 개발 단계의 망막의 murine 눈과 절개의 핵의 제거에있는 특성에 대한 ?…
Acknowledgements
저자는 기술 지원을 organotypic 문화와 미 Laub과 미 Gerster의 설립과 초기 도움 E. 드 라 로사와 AI Valenciano 감사하고 싶습니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Dissection microscope | Tool | ZEISS | ||
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco`s modified eagle`s medium / nutrient mixture F-12 Ham | Reagent | Sigma | D 8900 | DMEM / F-12 |
| Apo-transferin | Reagent | Sigma | T 1147 | |
| Putrescin | Reagent | Sigma | P 5780 | |
| Sodium selenite | Reagent | Sigma | S 9133 | |
| Progesterone | Reagent | Sigma | P 6149 | |
| Gentamicine | Reagent | Invitrogen | ||
| L-Glutamine | Reagent | Invitrogen | 25030-024 | 200 mM (100X), liquid |
| Bovine serum albumine (BSA) | Reagent | Roth | 8076.3 | 30 mg/ml |
| Collagenase | Reagent | Sigma | C 0773 | 200 U/ml |
| Trypsin | Reagent | Sigma | T4799 | From porcine pancreas; 1 mg/ml |
| Hyaluronidase | Reagent | Sigma | H 3884 | 200 mg/ml |
| DNase I | Reagent | Roche | 1 284 932 | 10 mg/ml |
| EDTA | Reagent | Sigma | E 6511 | |
| Silicone solution | Reagent | Serva | 35130 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Reagent | Sigma | P6148 | 8% PFA in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Reagent | Sigma | D 0542 | DAPI |
| Fluorescent Mounting Medium | Reagent | Dako | S3023 | |
| BrDU | Reagent | Sigma | B 9285 | |
| 96-well plates | Tool | FALCON | 3072 | |
| 24-well plates | Tool | FALCON | 3047 | |
| Pasteur pipettes | Tool | Brand | 747720 | |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors,straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 2ml; round bottom for better precipitation of pellet during centrifugation /cytospin | |
| Cooling centrifuge | Tool | Eppendorf | ||
| Rotation shaker | Tool | CAT | ||
| Cytospin | Tool | Thermo Scientific |
References
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