Summary
実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症(MS)の動物モデルであり、ヒトの疾患と強力な体液性自己免疫応答を共有しています。ここでは、EAE免疫マウスの血清中の自己抗体を定量するためのシンプルで柔軟なELISAプロトコルを報告します。
Abstract
実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) は、組織病理学的および分子レベルで自己免疫疾患である多発性硬化症 (MS) を再現する疾患モデルです。EAEは、短いミエリンペプチドと特異的なアジュバントを皮下注射 して 実験動物に免疫を与え、免疫応答を高めることによって誘導されます。ヒトマウスと同様に、EAEマウスは脱髄病変、中枢神経系(CNS)への免疫細胞浸潤、グリア活性化、および神経細胞損傷を発症します。一貫した一連の証拠は、MSとEAEの両方の病因におけるB細胞機能障害の機構的役割も支持しています。B細胞は、抗原提示細胞としてだけでなく、炎症誘発性サイトカインや自己抗体の主要な供給源としても機能します。EAEでは、病気を誘発するために使用されたミエリンペプチドに対する抗体が生成されます。このような自己抗体は、ミエリン喪失または病原性T細胞のCNSへの再活性化のいずれかを媒介することが示されています。この記事では、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質35-55(MOG35-55)ペプチドで免疫したC57BL/6Jマウスの血清中の自己抗体を定量するための効率的なELISAベースのプロトコルについて説明します。提案された方法は、自己免疫脱髄の文脈における異常な体液性応答の特異性と大きさを調査するための強力なツールとして機能します。
Introduction
多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)の慢性自己免疫疾患で、脳実質への免疫細胞の限局浸潤、軸索を包むミエリン鞘の破壊、グリアの活性化、およびニューロンの喪失を特徴とする1。病原性T細胞の確立された役割に加えて、複数の証拠が、CNSに対する自己免疫応答の媒介におけるB細胞の関与を強調しています。B細胞はMS脳でクローン増殖を起こし、ミエリン成分に対する抗体が脱髄病変内で検出されています2,3。疾患発症時の末梢B細胞の選択的活性化が最近文書化されており、疾患開始におけるこの免疫細胞コンパートメントの推定上の役割も示唆されています4。抗CD20モノクローナル抗体などのB細胞枯渇療法の成功は、異常なB細胞機能と自己免疫性脱髄との間の機構的関係をさらに裏付けています5,6。分子の観点から、B細胞は、自己抗原の提示、炎症誘発性サイトカイン分泌、および自己反応性抗体産生を介して疾患に寄与する可能性があります。
複雑なMS表現型の特定の特徴を再現するために、複数の動物モデルが開発されています。その中でも、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、 最も広く使用されているin vivo パラダイムであり、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)やミエリン塩基性タンパク質(MBP)7などのミエリンタンパク質に由来する短いペプチドによる実験動物の免疫に依存しています。EAE免疫動物は、脳原性ペプチド8に対する強力な体液性応答を含む、多くの面でMSに似た脱髄性病理を発症します。このため、EAE研究は、疾患の状況におけるB細胞と自己抗体の機能を解剖するのに役立ちました。たとえば、MS患者から単離されたMOG特異的抗体は、EAEモデル9の臨床経過を悪化させる可能性があることが実証されました。 特に、ヒトMOGにおける42位のプロリン残基は、自己抗体病原性を決定するために重要であることが示された10。最近では、MOG特異的自己抗体は、ミエリン喪失を媒介するだけでなく、CNS内の自己反応性T細胞の再活性化を促進することによっても疾患を促進することがわかっています11。
CNS自己免疫における抗体応答の重要性を考慮して、この記事では、MOG35-55ペプチドで免疫したC57BL / 6JマウスEAEの自己反応性抗体の血清レベルを効率的に測定するためのELISAベースのプロトコルを紹介します。プロトコルの最初の部分では、心臓内穿刺 を介して 血清を採取する方法について説明します。その後、ELISAアッセイの設定とデータ取得の手順について詳しく説明します。最後に、データ分析と解釈について説明します。
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Protocol
マウスを含むすべての手順は、イーストカロライナ大学動物管理委員会(IACUC)によって承認された実験ガイドラインに準拠して実施されました。この研究では、8〜10週齢の野生型C57BL / 6J雌マウスを使用しました。動物は商業的な供給源から入手しました(資料の表を参照)。EAEは、以前に発表された報告12,13,14に続いて誘発されました。
1.美容液コレクション
- MOG35-55 免疫を介して EAE を誘導した後、必要な時点で CO2 窒息またはイソフルラン過剰摂取によって実験マウスを安楽死させます (施設で承認されたプロトコルに従う)。
注:マウスの総数と血清採取の時点は、特定の実験によって異なる場合があります。 - つま先や尻尾をつまんでバイタルサインがないことを確認したら、マウスを解剖トレイの背側横臥位にし、手足をピンやテープで固定します。マウスの体をLED光源( 材料の表を参照)に向け、動物の胸部を照らします。
- マウスの毛皮に70%エタノールをスプレーし、解剖ハサミを使用して骨盤から剣状突起まで腹部に沿って3〜4cmの正中線切開を行い、臓器や主要な血管を避けます(図1A-C)。手順を容易にするために、鉗子を使用して剣状突起の上に皮膚をつかみます。
- 横方向に切断し、スプリングはさみを使用して両側の端で胸郭を前方に切断し、正中線で胸骨に到達する前に停止します(図1D)。マウスの頭の上に作成したリブフラップを折りたたんで、心臓を露出させます(図1E)。
注:胸骨を切ると、骨に隣接する主胸動脈が損傷し、収集できる血液の量が減少するため、避ける必要があります。 - 1mLのシリンジに接続された25Gの針を左心室に挿入し、プランジャーを静かに引き戻して採血します(図1F)。針の穿刺を容易にするために、一対の鉗子に対して心臓をそっと支えます。
注:血液がすぐに注射器に現れない場合は、針をゆっくりと回転させ、別の角度でテストする必要があります。ただし、血液が漏れる可能性のある心臓に不必要な穴を開けないように、最初の試みで針を適切に配置する努力を払う必要があります。 - 血液を滅菌済みの1.5mLチューブに移し、室温で30分間凝固させます。2000 × gで4°Cで20分間遠心分離して血栓を除去します。 血清画分を表す上清を回収し、将来の試験のために、使い捨てアリコートを-80°Cの極低温チューブに保管します。
2. ELISAアッセイ
- 凍結乾燥したMOG35-55ペプチド( 材料の表を参照)を水に再懸濁して、10 mg/mLのストックを得ます。実験を開始する前に、ストックをコーティングバッファー( 材料表を参照)で10 μg/mLに希釈し、最終溶液の100 μL/ウェルを96ウェルプレートにピペットで移します。プレートを粘着フィルムで密封して蒸発を防ぎ、プレートを4°Cで一晩インキュベートします。
注:各サンプルに対して少なくとも2つのウェルを計算する必要があり、ブランクコントロール用に2つの追加のウェルも含める必要があります。 - 並行して、同じ数のウェルを、10 μg/mL 濃度のコーティングバッファーに溶解した 100 μL/ウェルのウシ血清アルブミン(BSA)でコーティングします。これらの追加の井戸は、バックグラウンドコントロールとして機能します。
注:コーティングバッファーとブロッキングバッファーの組成が異なるため、コントロールウェルをBSAでコーティングすることをお勧めします。他の脳炎誘発ペプチド(PLP139-151やMBP84-104など)は、BSAの代わりに無関係な抗原として使用できることに注意してください。. - 翌日、0.05% Tween 20 (PBS-T) を添加したリン酸緩衝生理食塩水 200 μL/ウェルでプレートを 3 回洗浄します。続いて、PBS中の3%BSA製のブロッキング溶液(Tween 20なし)を100 μL/ウェル加え、ハイブリダイゼーションオーブンで37°Cで1時間密封したプレートをインキュベートします。
- 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。各血清サンプルをブロッキング溶液で1:100に希釈し、MOG35-55とBSAコーティングウェルの両方に100 μL/ウェルを加えます。ブランクとして指定されたウェルに同じ量のブロッキング溶液を追加します。プレートを室温で2時間密封し、一定の振とう(250rpm)でインキュベートします。
- 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。HRP標識二次抗体(1:2000、 材料表を参照)をPBS-T中の0.2% BSA溶液で調製した溶液で希釈し、すべてのウェルに100 μL/ウェルを加えます。プレートを室温で1時間密封し、一定の振とう(250rpm)でインキュベートします。
- 200 μL/ウェルのPBS-Tでプレートを3回洗浄します。3,3',5,5'テトラメチルベンジジン(TMB)基質( 材料表を参照)の100 μL/ウェルをすべてのウェルに加え、暗所で1〜5分間インキュベートし、青色の発育を観察します。
- 100 μL/ウェルの停止溶液( 材料表を参照)を加えて反応を停止し、波長450 nmに設定されたプレートリーダーを使用して各ウェルの光学濃度(OD)を測定します。
注:TMB基質は、ウェルに添加する前に、室温で30〜60分間平衡化する必要があります。
- 100 μL/ウェルの停止溶液( 材料表を参照)を加えて反応を停止し、波長450 nmに設定されたプレートリーダーを使用して各ウェルの光学濃度(OD)を測定します。
3. データ分析
- プレートから読み取ったOD値をExcelスプレッドシートに入力します。各サンプルの重複ウェル(MOG35-55とBSAコーティングの両方)から得られたOD値を平均化します。
- 各サンプルについて、MOG35-55コーティングウェルの平均値からBSAコーティングウェルの平均値を差し引きます。結果として得られるバックグラウンド補正値は、さまざまな血清サンプル中の抗MOG35-55抗体の濃度に比例します。
注:ブランクウェルは、0付近で補正された値になります。 - マンホイットニーU検定などのノンパラメトリック統計的検定を適用して、2つの実験条件間の平均OD値を比較します。各条件に少なくとも3つの独立したサンプルを含めます。
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Representative Results
本ELISAアッセイの頑健性を実証するために、この方法は、C57BL/6J雌マウスのコホートから分離された血清サンプルを、免疫後20日(dpi)に、100μgのMOG35-55ペプチドを完全フロイントアジュバント(CFA)に従ったもので、検証済みのEAE誘導プロトコル12,13,14に従って試験した。動物はまた、0日目と2日目に400ngの百日咳毒素を投与されました。ペプチドを含まない模擬免疫動物からの血清サンプルは、ネガティブコントロールとして役立ちました。すべてのEAEマウスは、11〜14dpiの間に疾患の最初の徴候を発症し、20dpiまでに0〜6スケールで平均スコア2.6±0.6(標準誤差、SE)に達しました(0、徴候なし、1、尾部緊張の低下、2、軽度の単麻痺または対麻痺、3、重度の対麻痺、4、対麻痺、5、四肢麻痺、および6、瀕死または死亡)12。予想通り、EAEサンプルは対照サンプルと比較して有意に高いOD値を示しました(図2)。これらのデータは、疾患のピーク時にMOGペプチドに対する強力なIgG免疫グロブリン応答が存在することを裏付けています。
図1:心臓穿刺処置(A-E)成体マウスの心臓にアクセスするための開胸術の代表的な画像。(F)マウス心臓の左心室に針を挿入するための正しい手順の代表的な画像。解剖を容易にするために、関連する解剖学的構造が各パネルに示されています。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2:MOGペプチド自己抗体ELISAです。 抗MOG35-55 IgG免疫グロブリンの血清レベルは、報告されたELISAプロトコルを使用して、EAEおよび模擬免疫マウスで、免疫後20日(dpi)でテストされました。EAEサンプルでは、対照と比較して一貫して高いOD値が検出された。データは平均± SE (N = 3 per group)として表されます。グループ間の差は、片側マンホイットニーU検定*P ≤ 0.05によって評価されました。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、MS病理の関連する動物モデルにおける体液性反応を正確に定量化するために、シンプルで効率的なELISAベースのプロトコルが報告されました。この方法は、MOG35-55/C57BL6J EAEパラダイム12における自己抗体の血清レベルの制御におけるアタキシン-1タンパク質の新規の役割を説明するために最近採用されました。この点で、この方法で一貫した生物学的に意味のある結果を得るために、いくつかの要因を考慮する必要があります。
まず、高品質の血清サンプルを収集し、溶血を回避することが重要です。溶血度の高い検体中の赤血球から放出されるヘモグロビンやその他の細胞内成分は、ELISAアッセイにおける抗原抗体反応や相対色測定を妨げる可能性があります。溶血を防ぐために、赤血球が破裂する可能性があるため、採血中に注射器内の高い負圧を避けることが望ましいです。
第二に、血清サンプルを希釈して、吸光度曲線の線形部分内のOD値を得ることが重要です。推奨希釈係数(1:100)は、マウス系統で誘導されたEAE病理の実体について較正されました。この in vivo モデルの固有の不均一性を考慮すると、試験する特定のEAE病理の理想的な希釈係数を特定するために、予備滴定実験を実施することを強くお勧めします。同様に、TMB基質とのインキュベーション時間は、発色シグナルの飽和を回避し、OD値を0〜2の範囲内に維持するように調整できます。
第三に、このプロトコルで得られた補正されたOD値は、異なる実験条件間の自己抗体血清力価の半定量的分析、または疾患進行に沿った速度論的研究に適合します。自己抗体レベルの絶対定量が必要な場合は、検量線をELISAデザインに実装する必要があります。MOGペプチドに対する複数の抗体が市販されており、EAEマウスの血清中のMOG特異的抗体の濃度を計算するための信頼できる標準物質として使用することができます。さまざまな大きさの効果を捕捉するには、キャリブレーション抗体の幅広い希釈液(pg/mL から μg/mL の濃度)を含めることをお勧めします。
最後に、このプロトコルは非常に柔軟性があり、さまざまな研究ニーズに容易に適応させることができます。例えば、被覆された脳原性ペプチドは、他のEAEパラダイムにおける自己抗体応答を評価するために変化させることができる。さらに、異なる二次抗体を使用して、異なる免疫グロブリンクラスのレベルを測定することができます。この目的のために、このプロトコルは、アタキシン−1がMOGペプチド特異的抗体12のIgGおよびIgMクラスの両方を制御することを首尾よく実証した。最後に、MS患者の血液中の自己抗体を検出するための可能な用途が想定される可能性があります。ただし、EAEとMS疾患の間には大きな違いがあります。前者は、強力なアジュバントを持つ明確に定義された自己抗原に対する免疫応答を高める ことによって 人為的に誘導されますが、後者は自然発生的に発生し、明確な自己抗原はまだ特定されていません。最近の証拠は、ウイルスタンパク質と分子模倣の関与の可能性を示唆しています15。したがって、この動物モデルで収集された観察結果をヒトの病気に直接変換する際には、常に注意点を考慮する必要があります。
要約すると、本プロトコルは、市販のELISAキットに代わる簡単で便利な代替手段であり、自己免疫脱髄の文脈における自己抗体放出の正確な推定のために、細胞ベースのアッセイ(CBA)などの他の方法と効率的に組み合わせることができます。
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Disclosures
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、米国国立衛生研究所(R03NS131908)および国防総省の多発性硬化症研究プログラムを通じて、賞番号W81XWH-22-1-0517の支援を受けました。意見、解釈、結論、および推奨事項は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されているわけではありません。この研究は、イーストカロライナ大学のスタートアップファンドの支援も受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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