Summary
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (ईएई) मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) का एक पशु मॉडल है, जो मानव रोग के साथ एक मजबूत हास्य ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया साझा करता है। यहां, हम ईएई प्रतिरक्षित चूहों के सीरम में ऑटोएंटिबॉडी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और लचीले एलिसा प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
Abstract
प्रायोगिक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) एक रोग मॉडल है जो हिस्टोपैथोलॉजिकल और आणविक स्तरों पर ऑटोइम्यून डिसऑर्डर मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) को पुन: व्यवस्थित करता है। ईएई प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए विशिष्ट सहायक के साथ लघु माइलिन पेप्टाइड्स के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से प्रयोगात्मक जानवरों को प्रतिरक्षित करके प्रेरित किया जाता है। मानव समकक्ष की तरह, ईएई चूहों में डिमाइलेटिंग घाव, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ, ग्लिया सक्रियण और न्यूरोनल चोट विकसित होती है। साक्ष्य का एक सुसंगत शरीर एमएस और ईएई दोनों के एटियलजि में बी सेल डिसफंक्शन के लिए एक यंत्रवत भूमिका का भी समर्थन करता है। बी कोशिकाएं एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं के साथ-साथ प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन्स और ऑटोएंटिबॉडी के प्राथमिक स्रोत के रूप में काम कर सकती हैं। ईएई में, माइलिन पेप्टाइड्स के खिलाफ एंटीबॉडी उत्पन्न होते हैं जो रोग को प्रेरित करने के लिए नियोजित किए गए थे। इस तरह के ऑटोएंटिबॉडी को सीएनएस में माइलिन हानि या रोगजनक टी सेल पुनर्सक्रियन में मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है। यह लेख माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन 35-55 (MOG35-55) पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित C57BL/6J चूहों के सीरम में ऑटोएंटिबॉडी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक कुशल एलिसा-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रस्तावित विधि ऑटोइम्यून डिमाइलिनेशन के संदर्भ में असामान्य हास्य प्रतिक्रिया की विशिष्टता और परिमाण की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करती है।
Introduction
मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की एक पुरानी ऑटोइम्यून बीमारी है जो मस्तिष्क पैरेन्काइमा में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के फोकल घुसपैठ की विशेषता है, माइलिन शीथ रैपिंग अक्षतंतु, ग्लिया सक्रियण और न्यूरोनल हानि का टूटना1. रोगजनक टी कोशिकाओं की अच्छी तरह से स्थापित भूमिका के अलावा, सबूतों की कई पंक्तियों ने सीएनएस के खिलाफ ऑटोइम्यून प्रतिक्रिया की मध्यस्थता में बी कोशिकाओं की भागीदारी पर प्रकाश डाला है। बी कोशिकाओं एमएस मस्तिष्क में क्लोनल विस्तार से गुजरना और माइलिन घटकों के खिलाफ एंटीबॉडी demyelinated घावों 2,3 के भीतर पता चला है. रोग की शुरुआत में परिधीय बी कोशिकाओं के चयनात्मक सक्रियण हाल ही में प्रलेखित किया गया है, रोग दीक्षा में इस प्रतिरक्षा सेल डिब्बे के लिए एक ख्यात भूमिका का सुझाव के रूप में अच्छी तरह से4. एंटी-सीडी 20 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जैसे बी सेल-घटने वाले उपचारों की सफलता आगे एबेरेंट बी सेल कामकाज और ऑटोइम्यूनडिमाइलिनेशन 5,6के बीच यंत्रवत संबंध की पुष्टि करती है। आणविक दृष्टिकोण से, बी कोशिकाएं ऑटोएंटिजेन प्रस्तुति, प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्राव और ऑटोरिएक्टिव एंटीबॉडी उत्पादन के माध्यम से बीमारी में योगदान कर सकती हैं।
जटिल एमएस फेनोटाइप की विशिष्ट विशेषताओं को पुन: व्यवस्थित करने के लिए कई पशु मॉडल विकसित किए गए हैं। उनमें से, प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफैलोमाइलाइटिस (ईएई) विवो प्रतिमान में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और माइलिन ऑलिगोडेंड्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (एमओजी) और माइलिन बेसिक प्रोटीन (एमबीपी)7जैसे माइलिन प्रोटीन से प्राप्त छोटे पेप्टाइड्स के साथ प्रयोगात्मक जानवरों के टीकाकरण पर निर्भर करता है। ईएई प्रतिरक्षित जानवरों एक demyelinating विकृति है कि कई पहलुओं में एमएस जैसा दिखता है, एन्सेफैलिटोजेनिक पेप्टाइड8 के खिलाफ एक मजबूत हास्य प्रतिक्रिया सहित. इस कारण से, ईएई अध्ययन रोग के संदर्भ में बी कोशिकाओं और ऑटोएंटिबॉडी के कार्य को विच्छेदित करने में सहायक रहे हैं। उदाहरण के लिए, यह प्रदर्शित किया गया था कि एमएस रोगियों से अलग एमओजी-विशिष्ट एंटीबॉडी ईएई मॉडल9 में नैदानिक पाठ्यक्रम को बढ़ा सकते हैं। विशेष रूप से, मानव एमओजी में स्थिति 42 पर प्रोलाइन अवशेष ऑटोएन्टीबॉडी रोगजनकता10 निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया था। हाल ही में, एमओजी-विशिष्ट ऑटोएंटिबॉडी को न केवल माइलिन हानि की मध्यस्थता करके बल्कि सीएनएस11 के भीतर ऑटोरिएक्टिव टी कोशिकाओं के पुनर्सक्रियन को बढ़ावा देने के माध्यम से बीमारी को बढ़ावा देने के लिए पाया गया है।
सीएनएस ऑटोइम्यूनिटी में एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के महत्व को ध्यान में रखते हुए, यह लेख एमओजी35-55 पेप्टाइड के साथ प्रतिरक्षित सी 57 बीएल / 6 जे चूहों ईएई में ऑटोरिएक्टिव एंटीबॉडी के सीरम स्तर को कुशलतापूर्वक मापने के लिए एक एलिसा-आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रोटोकॉल के पहले भाग में, इंट्राकार्डिक पंचर के माध्यम से सीरम इकट्ठा करने की विधि का वर्णन किया जाएगा। इसके बाद, एलिसा परख स्थापित करने और डेटा प्राप्त करने की प्रक्रियाओं का विवरण दिया जाएगा। अंत में, डेटा विश्लेषण और व्याख्या पर चर्चा की जाएगी।
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Protocol
चूहों से जुड़े सभी प्रक्रियाओं पूर्वी कैरोलिना विश्वविद्यालय संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित प्रयोगात्मक दिशा निर्देशों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया. इस अध्ययन में 8-10 सप्ताह की उम्र के बीच वाइल्डटाइप C57BL/6J मादा चूहों का उपयोग किया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। ईएई पहले प्रकाशित रिपोर्ट 12,13,14 के बाद प्रेरित किया गया था.
1. सीरम संग्रह
- एमओजी 35-55 टीकाकरण के माध्यम से ईएई को प्रेरित करने के बाद आवश्यक समय बिंदु (संस्थागत रूप से अनुमोदित प्रोटोकॉल के बाद) पर सीओ2 श्वासावरोध या आइसोफ्लुरेन ओवरडोज द्वारा प्रयोगात्मक माउस को इच्छामृत्यु दें।
नोट: सीरम संग्रह के लिए चूहों और समय बिंदुओं की कुल संख्या विशिष्ट प्रयोग के अनुसार भिन्न हो सकती है। - महत्वपूर्ण संकेतों की अनुपस्थिति के बाद पैर की अंगुली या पूंछ चुटकी द्वारा पुष्टि की है, एक विच्छेदन ट्रे पर एक पृष्ठीय recumbency स्थिति में माउस जगह और पिन या टेप के साथ स्थिति में अंगों प्रत्यय. माउस शरीर को एलईडी प्रकाश स्रोत ( सामग्री की तालिकादेखें) को उन्मुख करने के लिए जानवर के वक्ष को रोशन करें।
- 70% इथेनॉल के साथ माउस फर स्प्रे करें और विच्छेदन कैंची का उपयोग करके श्रोणि से xiphoid तक पेट के साथ 3-4 सेमी की एक मिडलाइन चीरा बनाएं, किसी भी अंग और प्रमुख जहाजों (चित्रा 1ए-सी) से बचने के लिए देखभाल करें। प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए, xiphoid प्रक्रिया पर त्वचा को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- डायाफ्राम पार्श्व के माध्यम से काटें और फिर वसंत कैंची का उपयोग करके दोनों पार्श्व किनारों पर पूर्वकाल में रिब पिंजरे को काट लें, मिडलाइन(चित्रा 1डी)पर उरोस्थि तक पहुंचने से पहले रोक दें। दिल (चित्रा 1E) का पर्दाफाश करने के लिए माउस सिर पर बनाया गया था कि रिब प्रालंब मोड़ो.
नोट: उरोस्थि काटने से बचा जाना चाहिए क्योंकि यह हड्डी से सटे मुख्य वक्ष धमनियों को नुकसान पहुंचाएगा और एकत्र किए जा सकने वाले रक्त की मात्रा को कम करेगा। - बाएं वेंट्रिकल में 1 एमएल सिरिंज से जुड़ी 25 जी सुई डालें और धीरे से सवार (चित्रा 1 एफ) को वापस खींचकर रक्त एकत्र करें। सुई पंचर की सुविधा के लिए, धीरे संदंश की एक जोड़ी के खिलाफ दिल ब्रेस.
नोट: यदि रक्त सिरिंज में तुरंत प्रकट नहीं होता है, तो सुई को धीरे-धीरे घुमाया जाना चाहिए, और एक अलग कोण का परीक्षण किया जाना चाहिए। हालांकि, दिल में अनावश्यक छेद बनाने से बचने के लिए पहले प्रयास पर सुई को ठीक से रखने के प्रयास किए जाने चाहिए जहां रक्त बाहर निकल सकता है। - रक्त को एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए थक्का बनने दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 2000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा थक्का निकालें। सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए, जो सीरम अंश का प्रतिनिधित्व करता है, और भविष्य के परीक्षण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोजेनिक ट्यूबों में एकल-उपयोग एलिकोट स्टोर करें।
2. एलिसा परख
- 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक प्राप्त करने के लिए पानी में लियोफिलिज्ड एमओजी 35-55 पेप्टाइड ( सामग्री की तालिकादेखें) को फिर से निलंबित करें। प्रयोग शुरू करने से पहले, कोटिंग बफर में स्टॉक को 10 माइक्रोग्राम/एमएल तक पतला करें ( सामग्री की तालिकादेखें) और अंतिम समाधान के विंदुक 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से 96-अच्छी प्लेट में। वाष्पीकरण से बचने के लिए एक चिपकने वाली फिल्म के साथ प्लेट को सील करें और प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रत्येक नमूने के लिए कम से कम 2 कुओं की गणना की जानी चाहिए और रिक्त नियंत्रण के लिए 2 अतिरिक्त कुओं को भी शामिल किया जाना चाहिए। - समानांतर में, 10 माइक्रोग्राम/एमएल एकाग्रता पर कोटिंग बफर में भंग गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से कुओं की समान संख्या को कोट करें। ये अतिरिक्त कुएं पृष्ठभूमि नियंत्रण के रूप में काम करेंगे।
नोट: बीएसए के साथ कोट करने की सिफारिश की जाती है नियंत्रण कुओं के बाद से कोटिंग और अवरुद्ध बफ़र्स में अलग-अलग रचनाएं होती हैं। कृपया ध्यान दें कि अन्य एन्सेफैलिटोजेनिक पेप्टाइड्स (जैसे पीएलपी 139-151 या एमबीपी 84-104) का उपयोग बीएसए के विकल्प में अप्रासंगिक एंटीजन के रूप में किया जा सकता है। - दिन के बाद, 0.05% ट्वीन 20 (पीबीएस-टी) के साथ पूरक फॉस्फेट बफर खारा के 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से 3 बार प्लेट धो लें। इसके बाद, पीबीएस (ट्वीन 20 के बिना) में 3% बीएसए से बने अवरुद्ध समाधान के 100 माइक्रोन/वेल जोड़ें और संकरण ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सील की गई प्लेट को इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस-टी के 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से के साथ प्लेट को 3 बार धोएं। अवरुद्ध समाधान में प्रत्येक सीरम नमूना 1:100 पतला करें और एमओजी35-55 और बीएसए लेपित कुओं दोनों में 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें। रिक्त स्थान के रूप में नामित कुओं के लिए अवरुद्ध समाधान की एक ही मात्रा जोड़ें। कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सील प्लेट सेते हैं, लगातार मिलाते हुए (250 आरपीएम) के साथ.
- पीबीएस-टी के 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से के साथ प्लेट को 3 बार धोएं। पीबीएस-टी में 0.2% बीएसए से बने समाधान में एचआरपी-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:2000, सामग्री की तालिकादेखें) को पतला करें और सभी कुओं में 100 माइक्रोन/अच्छी तरह से जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सील प्लेट सेते हैं, लगातार मिलाते हुए (250 आरपीएम) के साथ.
- पीबीएस-टी के 200 माइक्रोन/अच्छी तरह से के साथ प्लेट को 3 बार धोएं। सभी कुओं में 3,3', 5,5' टेट्रामेथिलबेनज़िडाइन (टीएमबी) सब्सट्रेट ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन/वेल जोड़ें और नीले रंग के विकास की निगरानी करते हुए 1-5 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
- स्टॉप समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन/वेल जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें और 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर सेट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें।
नोट: टीएमबी सब्सट्रेट को कुओं में जोड़ने से पहले 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए।
- स्टॉप समाधान ( सामग्री की तालिकादेखें) के 100 माइक्रोन/वेल जोड़कर प्रतिक्रिया को रोकें और 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर सेट प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) को मापें।
3. डेटा विश्लेषण
- प्लेट से पढ़े गए OD मानों के साथ एक एक्सेल स्प्रेडशीट को पॉप्युलेट करें। प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट कुओं (एमओजी 35-55 और बीएसए लेपित दोनों) से प्राप्त आयुध डिपो मूल्यों का औसत।
- प्रत्येक नमूने के लिए, बीएसए-लेपित कुओं के औसत मूल्य को एमओजी35-55 लेपित कुओं से घटाएं। परिणामी पृष्ठभूमि सही मान विभिन्न सीरम नमूनों में एंटी-मोग 35-55 एंटीबॉडी की एकाग्रता के लिए आनुपातिक होंगे।
नोट: रिक्त कुओं के परिणामस्वरूप 0 के आसपास सही मान होना चाहिए। - दो प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच औसत आयुध डिपो मूल्यों की तुलना करने के लिए मान-व्हिटनी यू परीक्षण जैसे गैर-पैरामीट्रिक सांख्यिकीय परीक्षण लागू करें। प्रत्येक हालत के लिए कम से कम 3 स्वतंत्र नमूने शामिल करें.
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Representative Results
वर्तमान एलिसा परख की मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए, विधि का परीक्षण 20 दिनों के बाद टीकाकरण (डीपीआई) में सी 57 बीएल/6 जे महिला चूहों के एक समूह से अलग सीरम नमूनों पर किया गया था, जिसमें पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) में एमओजी 35-55 पेप्टाइड के 100 माइक्रोग्राम के साथ एक मान्य ईएई प्रेरण प्रोटोकॉल 12,13,14 का पालन किया गया था। जानवरों को दिन 0 और 2 पर पर्टुसिस विष के 400 एनजी भी प्राप्त हुए। नकली प्रतिरक्षित जानवरों से सीरम के नमूने सब कुछ के साथ लेकिन पेप्टाइड के बिना नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। सभी ईएई चूहों ने 11-14 डीपीआई के बीच बीमारी के पहले लक्षण विकसित किए और 20-6 पैमाने पर 2.6 ± 0.6 (मानक त्रुटि, एसई) के औसत स्कोर तक पहुंच गए (0, कोई संकेत नहीं; 1, पूंछ टोन में कमी; 2, हल्के मोनोपेरिसिस या पैरापेरेसिस; 3, गंभीर पैरापेरेसिस; 4, पैरापलेजिया; 5, क्वाड्रिपेरिसिस; और 6, मरणासन्न या मृत्यु)12. जैसा कि अपेक्षित था, ईएई नमूनों ने नियंत्रण नमूनों (चित्रा 2)की तुलना में काफी अधिक आयुध डिपो मूल्यों को प्रदर्शित किया। ये आंकड़े रोग के चरम पर एमओजी पेप्टाइड के खिलाफ एक मजबूत आईजीजी इम्युनोग्लोबुलिन प्रतिक्रिया की उपस्थिति की पुष्टि करते हैं।
चित्रा 1: कार्डियक पंचर प्रक्रिया। (ए-ई) वयस्क चूहों में दिल तक पहुंचने के लिए थोरैकोटॉमी प्रक्रिया की प्रतिनिधि छवियां। (एफ)माउस दिल के बाएं वेंट्रिकल में सुई सम्मिलन के लिए सही प्रक्रिया की प्रतिनिधि छवि। विच्छेदन की सुविधा के लिए प्रत्येक पैनल में प्रासंगिक शारीरिक संरचनाओं का संकेत दिया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: एमओजी पेप्टाइड ऑटोएन्टीबॉडी एलिसा। एंटी-एमओजी 35-55 आईजीजी इम्युनोग्लोबुलिन के सीरम स्तर का परीक्षण ईएई में किया गया था और रिपोर्ट किए गए एलिसा प्रोटोकॉल का उपयोग करके 20 दिनों के बाद टीकाकरण (डीपीआई) में नकली प्रतिरक्षित चूहों का परीक्षण किया गया था। नियंत्रण की तुलना में ईएई नमूनों में लगातार उच्च आयुध डिपो मूल्यों का पता चला था। डेटा को एसई (एन = 3 प्रति समूह) ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। समूहों के बीच अंतर का मूल्यांकन एक-पूंछ वाले मान-व्हिटनी यू परीक्षण, * पी ≤ 0.05 द्वारा किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यहां, एमएस पैथोलॉजी के एक प्रासंगिक पशु मॉडल में हास्य प्रतिक्रिया को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए एक सरल और कुशल एलिसा-आधारित प्रोटोकॉल की सूचना दी गई थी। इस विधि को हाल ही में MOG35-55/C57BL6J EAE प्रतिमान12 में स्वप्रतिपिंडों के सीरम स्तर को नियंत्रित करने में ataxin-1 प्रोटीन की उपन्यास भूमिका का वर्णन करने के लिए नियोजित किया गया है। इस संबंध में, इस पद्धति के साथ सुसंगत और जैविक रूप से सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।
सबसे पहले, उच्च गुणवत्ता वाले सीरम नमूने एकत्र करना और हेमोलिसिस से बचना महत्वपूर्ण है। भारी हेमोलाइज्ड नमूनों में लाल रक्त कोशिकाओं से जारी हीमोग्लोबिन और अन्य इंट्रासेल्युलर घटक एलिसा परख में एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया और सापेक्ष रंग माप में हस्तक्षेप कर सकते हैं। हेमोलिसिस को रोकने के लिए, रक्त संग्रह के दौरान सिरिंज में उच्च नकारात्मक दबाव से बचना बेहतर होता है क्योंकि इससे एरिथ्रोसाइट्स फट सकते हैं।
दूसरा, अवशोषण वक्र के रैखिक भाग के भीतर आयुध डिपो मान प्राप्त करने के लिए सीरम नमूनों को पतला करना महत्वपूर्ण है। हमारे अनुशंसित कमजोर पड़ने कारक (1:100) हमारे माउस उपभेदों में प्रेरित ईएई विकृति विज्ञान की इकाई पर कैलिब्रेट किया गया था। विवो मॉडल में इस की विषमता के आंतरिक स्तर को ध्यान में रखते हुए, परीक्षण किए गए विशिष्ट ईएई पैथोलॉजी के लिए आदर्श कमजोर पड़ने वाले कारक की पहचान करने के लिए प्रारंभिक अनुमापन प्रयोगों को करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। इसी तरह, टीएमबी सब्सट्रेट के साथ इनक्यूबेशन समय को क्रोमोजेनिक सिग्नल की संतृप्ति से बचने और 0-2 रेंज के भीतर ओडी मूल्यों को बनाए रखने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
तीसरा, इस प्रोटोकॉल में प्राप्त सही आयुध डिपो मूल्यों विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच या रोग प्रगति के साथ गतिज अध्ययन के लिए autoantibody सीरम टाइटर्स के एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संगत कर रहे हैं. यदि ऑटोएंटिबॉडी स्तरों की पूर्ण मात्रा का ठहराव आवश्यक है, तो एलिसा डिजाइन में एक अंशांकन वक्र लागू किया जाना चाहिए। एमओजी पेप्टाइड के खिलाफ कई एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और ईएई चूहों के सीरम में एमओजी-विशिष्ट एंटीबॉडी की एकाग्रता की गणना करने के लिए विश्वसनीय मानकों के रूप में उपयोग किया जा सकता है। विभिन्न परिमाण के प्रभावों को पकड़ने के लिए, अंशांकन एंटीबॉडी (पीजी/एमएल से लेकर μg/एमएल सांद्रता तक) के लिए कमजोर पड़ने की एक विस्तृत श्रृंखला को शामिल करने की सिफारिश की जाती है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल बेहद लचीला है और विभिन्न अनुसंधान आवश्यकताओं को समायोजित करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लेपित एन्सेफैलिटोजेनिक पेप्टाइड को अन्य ईएई प्रतिमानों में ऑटोएंटिबॉडी प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए विविध किया जा सकता है। इसके अलावा, अलग-अलग इम्युनोग्लोबुलिन वर्गों के स्तर को मापने के लिए विभिन्न माध्यमिक एंटीबॉडी को नियोजित किया जा सकता है। यह अंत करने के लिए, इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक प्रदर्शित किया है कि ataxin-1 एमओजी पेप्टाइड विशिष्ट एंटीबॉडी12 के आईजीजी और आईजीएम वर्गों दोनों को नियंत्रित करता है. अंत में, यह एमएस रोगियों के रक्त में ऑटोएंटिबॉडी का पता लगाने के लिए एक संभावित उपयोग की कल्पना की जा सकती है। हालांकि, ईएई और एमएस रोगों के बीच पर्याप्त अंतर मौजूद हैं। जबकि पूर्व कृत्रिम रूप से मजबूत सहायक के साथ एक अच्छी तरह से परिभाषित ऑटोएंटिजेन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के माध्यम से प्रेरित होता है, बाद वाला अनायास उत्पन्न होता है और अभी तक कोई स्पष्ट ऑटोएंटिगेंस की पहचान नहीं की गई है। हाल के सबूत वायरल प्रोटीन15 के साथ आणविक नकल की संभावित भागीदारी का सुझाव देते हैं. इसलिए, इस पशु मॉडल में एकत्र किए गए अवलोकनों को मानव रोग में सीधे अनुवाद करने में हमेशा चेतावनी पर विचार किया जाना चाहिए।
संक्षेप में, वर्तमान प्रोटोकॉल वाणिज्यिक एलिसा किट के लिए एक आसान और सुविधाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है और ऑटोइम्यून डिमाइलिनेशन के संदर्भ में ऑटोएंटिबॉडी रिलीज के सटीक अनुमान के लिए सेल-आधारित परख (सीबीए) जैसे अन्य तरीकों के साथ कुशलतापूर्वक जोड़ा जा सकता है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
इस अध्ययन को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R03NS131908) और रक्षा विभाग द्वारा पुरस्कार संख्या W81XWH-22-1-0517 के तहत मल्टीपल स्केलेरोसिस रिसर्च प्रोग्राम के माध्यम से समर्थित किया गया था। राय, व्याख्याएं, निष्कर्ष और सिफारिशें लेखक की हैं और जरूरी नहीं कि रक्षा विभाग द्वारा उनका समर्थन किया जाए। इस अध्ययन को पूर्वी कैरोलिना विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड द्वारा भी समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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