Summary
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это животная модель рассеянного склероза (РС), которая разделяет с болезнью человека устойчивый гуморальный аутоиммунный ответ. Здесь мы сообщаем о простом и гибком протоколе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке мышей, иммунизированных EAE.
Abstract
Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) — это модель заболевания, которая повторяет аутоиммунное заболевание рассеянный склероз (РС) на гистопатологическом и молекулярном уровнях. ЭАЭ индуцируется иммунизацией экспериментальных животных путем подкожной инъекции коротких пептидов миелина вместе со специфическими адъювантами для усиления иммунного ответа. Как и у человека, у мышей EAE развиваются демиелинизирующие поражения, инфильтрация иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС), активация глии и повреждение нейронов. Последовательная совокупность доказательств также поддерживает механистическую роль дисфункции В-клеток в этиологии как РС, так и ЭАЭ. В-клетки могут служить антигенпрезентирующими клетками, а также основным источником провоспалительных цитокинов и аутоантител. При EAE вырабатываются антитела против пептидов миелина, которые были использованы для индуцирования заболевания. Было показано, что такие аутоантитела опосредуют либо потерю миелина, либо реактивацию патогенных Т-клеток в ЦНС. В данной статье описан эффективный протокол на основе ИФА для количественного определения аутоантител в сыворотке крови мышей C57BL/6J, иммунизированных пептидом миелина олигодендроцитарного гликопротеина 35-55 (MOG35-55). Предложенный метод служит мощным инструментом для исследования специфичности и величины аберрантного гуморального ответа в контексте аутоиммунной демиелинизации.
Introduction
Рассеянный склероз (РС) — это хроническое аутоиммунное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), характеризующееся очаговой инфильтрацией иммунных клеток в паренхиму головного мозга, разрушением миелиновых оболочек, обволакивающих аксоны, активацией глии и потерей нейронов1. В дополнение к хорошо установленной роли патогенных Т-клеток, многочисленные линии доказательств подчеркнули участие В-клеток в опосредовании аутоиммунного ответа против ЦНС. В-клетки подвергаются клональной экспансии в мозге РС, и антитела против компонентов миелина были обнаружены в демиелинизированных поражениях 2,3. Недавно была задокументирована селективная активация периферических В-клеток в начале заболевания, что предполагает предполагаемую роль этого компартмента иммунных клеток в инициации заболевания4. Успех терапии, истощающей В-клетки, такой как моноклональные антитела против CD20, еще больше подтверждает механистическую связь между аберрантным функционированием В-клеток и аутоиммунной демиелинизацией 5,6. С молекулярной точки зрения, В-клетки могут способствовать заболеванию через презентацию аутоантигена, секрецию провоспалительных цитокинов и выработку аутореактивных антител.
Было разработано несколько животных моделей, чтобы обобщить специфические особенности сложного фенотипа рассеянного склероза. Среди них экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является наиболее широко используемой парадигмой in vivo и опирается на иммунизацию экспериментальных животных короткими пептидами, полученными из белков миелина, таких как гликопротеин миелина олигодендроцитов (MOG) и основной белок миелина (MBP)7. У животных, иммунизированных EAE, развивается демиелинизирующая патология, которая во многих аспектах напоминает рассеянный склероз, включая устойчивый гуморальный ответ против энцефалитогенного пептида8. По этой причине исследования ЭАЭ сыграли важную роль в анализе функции В-клеток и аутоантител в контексте заболевания. Например, было показано, что MOG-специфические антитела, выделенные у пациентов с РС, могут усугубить клиническое течение в модели ЭАЭ9. Примечательно, что остаток пролина в положении 42 в MOG человека имеет решающее значение для определения патогенности аутоантител10. Совсем недавно было обнаружено, что MOG-специфические аутоантитела способствуют заболеванию не только за счет опосредования потери миелина, но и за счет повышения реактивации аутореактивных Т-клеток в ЦНС11.
Учитывая важность ответов антител при аутоиммунных заболеваниях ЦНС, в данной статье представлен протокол на основе ИФА для эффективного измерения сывороточных уровней аутореактивных антител у мышей ЭАЭ C57BL/6J, иммунизированных пептидом MOG35-55. В первой части протокола будет описан метод сбора сыворотки с помощью внутрисердечной пункции. Затем будут подробно описаны процедуры настройки ИФА-анализа и получения данных. Наконец, будет обсуждаться анализ и интерпретация данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием мышей были выполнены в соответствии с экспериментальными рекомендациями, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Восточной Каролины. В этом исследовании использовались самки мышей дикого типа C57BL/6J в возрасте от 8 до 10 недель. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). ЭАЭ была индуцирована после ранее опубликованных отчетов 12,13,14.
1. Сбор сыворотки
- Усыпить подопытную мышь путем удушьяСО2 или передозировки изофлурана в требуемый момент времени (в соответствии с институционально утвержденными протоколами) после индукции ЭАЭ с помощью иммунизации MOG35-55.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество мышей и временные моменты сбора сыворотки могут варьироваться в зависимости от конкретного эксперимента. - После того, как отсутствие жизненно важных признаков будет подтверждено защемлением пальца ноги или хвоста, поместите мышь в положение лежачего на спине на подносе для вскрытия и закрепите конечности булавками или лентой. Сориентируйте корпус мыши на светодиодный источник света (см. Таблицу материалов), чтобы осветить грудную клетку животного.
- Сбрызните шерсть мыши 70% этанолом и сделайте разрез по средней линии 3-4 см вдоль живота от таза до мечевидной кости с помощью диссекторных ножниц, стараясь избегать каких-либо органов и крупных сосудов (рис. 1A-C). Чтобы облегчить процедуру, используйте щипцы, чтобы захватить кожу над мечевидным отростком.
- Разрежьте диафрагму сбоку, а затем разрежьте грудную клетку спереди по обоим боковым краям с помощью пружинных ножниц, останавливаясь, не доходя до грудины по средней линии (рисунок 1D). Сложите ребристый клапан, который был создан над головой мыши, чтобы обнажить сердце (рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать разреза грудины, так как это повредит основные грудные артерии, прилегающие к кости, и уменьшит объем крови, которую можно собрать. - Введите иглу 25 G, соединенную со шприцем объемом 1 мл, в левый желудочек и соберите кровь, осторожно потянув поршень назад (рисунок 1F). Чтобы облегчить прокол иглой, аккуратно прижмите сердце к щипцам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кровь не сразу попадает в шприц, иглу следует медленно вращать и проверить другой угол. Тем не менее, следует приложить усилия, чтобы правильно разместить иглу с первой попытки, чтобы избежать создания ненужных отверстий в сердце, из которых может вытекать кровь. - Переложите кровь в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и дайте ей свертываться в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить сгусток центрифугированием при 2000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, которая представляет собой сывороточную фракцию, и храните одноразовые аликвоты в криогенных пробирках при температуре -80 °C для будущих испытаний.
2. ИФА-анализ
- Ресуспендируйте лиофилизированный пептид MOG35-55 (см. Таблицу материалов) в воде с получением запаса 10 мг/мл. Перед началом эксперимента разбавьте массу до 10 мкг/мл в буфере для покрытия (см. Таблицу материалов) и пипетируйте 100 мкл/лунку конечного раствора в 96-луночный планшет. Запечатайте планшет клейкой пленкой, чтобы избежать испарения, и инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пробы следует рассчитать не менее 2 лунок, а также включить 2 дополнительные скважины для контроля холостого колодца. - Параллельно покрыть то же количество лунок 100 μл/лунку бычьим сывороточным альбумином (БСА), растворенным в буфере покрытия в концентрации 10 мкг/мл. Эти дополнительные скважины будут служить фоновым контролем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контрольные лунки рекомендуется покрыть БСА, так как покрытие и блокирующие буферы имеют разный состав. Обратите внимание, что другие энцефалитогенные пептиды (такие как PLP139-151 или MBP84-104) могут быть использованы в качестве нерелевантных антигенов в качестве альтернативы BSA. - На следующий день промойте планшет 3 раза 200 μл фосфатного буферного раствора с добавлением 0,05% Tween 20 (PBS-T). Затем добавляют 100 л/лунку блокирующего раствора, изготовленного из 3% БСА, в PBS (без Tween 20) и инкубируют планшет в герметичном виде в течение 1 ч при 37 °C в гибридизационной печи.
- Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Разбавьте каждый образец сыворотки 1:100 в блокирующем растворе и добавьте 100 мкл/лунку в лунки с покрытием MOG35-55 и BSA. Добавьте такой же объем запорного раствора в лунки, обозначенные как заготовки. Инкубировать укупоренную пластину в течение 2 ч при комнатной температуре, при постоянном встряхивании (250 об/мин).
- Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Разбавить HRP-конъюгированное вторичное антитело (1:2000, см. таблицу материалов) в растворе, изготовленном из 0,2% BSA в PBS-T и добавить 100 мкл/лунку во все лунки. Инкубировать планшет в закрытом виде в течение 1 ч при комнатной температуре, при постоянном встряхивании (250 об/мин).
- Промойте планшет 3 раза 200 μл PBS-T. Добавьте во все лунки 100 мкл/лунку субстрата 3,3',5,5' тетраметилбензидина (ТМБ) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в темноте в течение 1-5 мин, наблюдая за развитием синего цвета.
- Остановите реакцию, добавив 100 μл/лунку стоп-раствора (см. Таблицу материалов) и измерьте оптическую плотность (OD) в каждой лунке с помощью планшетного ридера, установленного на длине волны 450 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Субстрат TMB следует уравновесить при комнатной температуре в течение 30-60 минут, прежде чем добавлять его в лунки.
- Остановите реакцию, добавив 100 μл/лунку стоп-раствора (см. Таблицу материалов) и измерьте оптическую плотность (OD) в каждой лунке с помощью планшетного ридера, установленного на длине волны 450 нм.
3. Анализ данных
- Заполните электронную таблицу Excel значениями наружного диаметра, считанными с таблички. Усреднить значения наружного диаметра, полученные из дублирующих скважин (как с покрытием MOG35-55, так и с покрытием BSA) для каждой пробы.
- Для каждого образца вычтите среднее значение лунок с покрытием BSA из значения лунок с покрытием MOG35-55. Полученные фоновые скорректированные значения будут пропорциональны концентрации антител против MOG35-55 в различных образцах сыворотки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые колодцы должны приводить к скорректированным значениям около 0. - Примените непараметрический статистический критерий, такой как U-критерий Манна-Уитни, чтобы сравнить средние значения наружного диаметра в двух экспериментальных условиях. Включите не менее 3 независимых образцов для каждого состояния.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать надежность настоящего ИФА-анализа, метод был протестирован на образцах сыворотки, выделенных из когорты самок мышей C57BL/6J через 20 дней после иммунизации (dpi) со 100 мкг пептида MOG35-55 в полном адъюванте Фрейнда (CFA) в соответствии с валидированным протоколом индукции EAE 12,13,14. Животные также получили 400 нг коклюшного токсина на 0 и 2 день. Образцы сыворотки от имитационных иммунизированных животных со всем, кроме пептида, служили отрицательным контролем. У всех мышей EAE развились первые признаки заболевания в диапазоне от 11 до 14 точек на дюйм, и к 20 точкам на дюйм средний балл составил 2,6 ± 0,6 (стандартная ошибка, SE) по шкале от 0 до 6 (0, без признаков; 1 — снижение тонуса хвоста; 2 — легкий монопарез или парапарез; 3 — тяжелый парапарез; 4 — параплегия; 5 — квадрипарез; и 6 — умирание или смерть)12. Как и ожидалось, образцы EAE показали значительно более высокие значения наружного диаметра по сравнению с контрольными образцами (рис. 2). Эти данные подтверждают наличие стойкого иммуноглобулинового ответа IgG против пептида MOG на пике заболевания.
Рисунок 1: Процедура пункции сердца. (A-E) Репрезентативные изображения процедуры торакотомии для доступа к сердцу у взрослых мышей. (F) Репрезентативное изображение правильной процедуры введения иглы в левый желудочек сердца мыши. Соответствующие анатомические структуры указаны на каждой панели для облегчения вскрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: ИФА аутоантитела к пептиду MOG. Сывороточные уровни иммуноглобулинов против MOG35-55 IgG были проверены на EAE и фиктивных иммунизированных мышах через 20 дней после иммунизации (dpi) с использованием протокола ИФА. Стабильно более высокие значения OD были обнаружены в образцах EAE по сравнению с контрольной группой. Данные представлены в виде средних значений ± SE (N = 3 на группу). Различия между группами оценивались с помощью одностороннего U-критерия Манна-Уитни, *P ≤ 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь сообщалось о простом и эффективном протоколе на основе ИФА для точной количественной оценки гуморального ответа в соответствующей животной модели патологии рассеянного склероза. Этот метод недавно был использован для описания новой роли белка атаксина-1 в контроле сывороточных уровней аутоантител в парадигме MOG35-55/C57BL6J EAE12. В связи с этим следует учитывать ряд факторов, чтобы получить последовательные и биологически значимые результаты с помощью этого метода.
Во-первых, важно собрать высококачественные образцы сыворотки и избежать гемолиза. Гемоглобин и другие внутриклеточные компоненты, высвобождаемые из эритроцитов в сильно гемолизированных образцах, могут влиять на реакцию антиген-антитело и измерение относительного цвета в анализе ИФА. Для предотвращения гемолиза предпочтительно избегать высокого отрицательного давления в шприце во время забора крови, так как это может привести к разрыву эритроцитов.
Во-вторых, важно разбавить образцы сыворотки для получения значений OD в линейной части кривой поглощения. Рекомендуемый нами коэффициент разведения (1:100) был откалиброван по сущности патологии EAE, индуцированной в наших линиях мышей. Учитывая внутренний уровень гетерогенности этой модели in vivo , настоятельно рекомендуется провести предварительные эксперименты по титрованию для определения идеального фактора разведения для конкретной исследуемой патологии EAE. Аналогичным образом, время инкубации с субстратом TMB может быть скорректировано таким образом, чтобы избежать насыщения хромогенного сигнала и поддерживать значения наружного диаметра в диапазоне 0-2.
В-третьих, скорректированные значения OD, полученные в этом протоколе, совместимы с полуколичественным анализом титров сыворотки аутоантител в различных экспериментальных условиях или для кинетических исследований прогрессирования заболевания. Если требуется абсолютное количественное определение уровней аутоантител, калибровочная кривая должна быть реализована в дизайне ИФА. Несколько антител против пептида MOG коммерчески доступны и могут быть использованы в качестве надежных стандартов для расчета концентрации MOG-специфических антител в сыворотке мышей EAE. Для улавливания эффектов различной величины рекомендуется включать широкий диапазон разведений для калибровочного антитела (в диапазоне концентраций от пг/мл до мкг/мл).
Наконец, этот протокол чрезвычайно гибок и может быть легко адаптирован к различным исследовательским потребностям. Например, покрытый оболочкой энцефалитогенный пептид можно варьировать для оценки ответа аутоантител в других парадигмах EAE. Кроме того, различные вторичные антитела могут быть использованы для измерения уровней различных классов иммуноглобулинов. С этой целью этот протокол успешно продемонстрировал, что атаксин-1 контролирует классы IgG и IgM пептид-специфических антител MOG12. Наконец, можно представить возможное использование для обнаружения аутоантител в крови пациентов с рассеянным склерозом. Тем не менее, существуют существенные различия между заболеваниями ЭАЭ и РС. В то время как первый искусственно индуцируется путем усиления иммунного ответа против четко определенного аутоантигена с помощью сильных адъювантов, второй возникает спонтанно, и однозначные аутоантигены еще не идентифицированы. Последние данные свидетельствуют о возможном участии молекулярной мимикрии с вирусными белками15. Следовательно, всегда следует учитывать предостережения при прямом переводе наблюдений, собранных в этой животной модели, на болезнь человека.
Таким образом, настоящий протокол представляет собой простую и удобную альтернативу коммерческим наборам для ИФА и может быть эффективно комбинирован с другими методами, такими как клеточные анализы (CBA), для точной оценки высвобождения аутоантител в контексте аутоиммунной демиелинизации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальными институтами здравоохранения (R03NS131908) и Министерством обороны в рамках Программы исследований рассеянного склероза в рамках награды No W81XWH-22-1-0517. Мнения, интерпретации, выводы и рекомендации принадлежат автору и не обязательно одобрены Министерством обороны. Это исследование также было поддержано стартап-фондами Университета Восточной Каролины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A.
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
