Summary
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.
Abstract
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Krankheitsmodell, das die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose (MS) auf histopathologischer und molekularer Ebene rekapituliert. EAE wird durch Immunisierung von Versuchstieren durch subkutane Injektion von kurzen Myelinpeptiden zusammen mit spezifischen Adjuvantien induziert, um die Immunantwort zu verstärken. Wie das menschliche Gegenstück entwickeln EAE-Mäuse demyelinisierende Läsionen, die Infiltration von Immunzellen in das Zentralnervensystem (ZNS), die Aktivierung von Gliazellen und neuronale Verletzungen. Eine konsistente Evidenz unterstützt auch eine mechanistische Rolle der B-Zell-Dysfunktion in der Ätiologie von MS und EAE. B-Zellen können sowohl als Antigen-präsentierende Zellen als auch als primäre Quelle für entzündungsfördernde Zytokine und Autoantikörper dienen. Bei der EAE werden Antikörper gegen die Myelinpeptide gebildet, die zur Induktion der Krankheit eingesetzt wurden. Es wurde gezeigt, dass solche Autoantikörper entweder den Myelinverlust oder die pathogene Reaktivierung von T-Zellen im ZNS vermitteln. Dieser Artikel beschreibt ein effizientes ELISA-basiertes Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von C57BL/6J-Mäusen, die mit dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-Peptid immunisiert wurden. Die vorgeschlagene Methode dient als leistungsfähiges Werkzeug, um die Spezifität und das Ausmaß der aberranten humoralen Reaktion im Zusammenhang mit der autoimmunen Demyelinisierung zu untersuchen.
Introduction
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische Autoimmunerkrankung des Zentralnervensystems (ZNS), die durch fokale Infiltration von Immunzellen in das Hirnparenchym, den Abbau von Myelinscheiden, die Axone umhüllen, die Gliaaktivierung und neuronalen Verlust gekennzeichnetist 1. Zusätzlich zu der gut etablierten Rolle pathogener T-Zellen haben mehrere Beweise die Beteiligung von B-Zellen an der Vermittlung der Autoimmunantwort gegen das ZNS hervorgehoben. B-Zellen durchlaufen im MS-Gehirn eine klonale Expansion, und Antikörper gegen Myelinkomponenten wurden in demyelinisierten Läsionen nachgewiesen 2,3. Die selektive Aktivierung von peripheren B-Zellen zu Beginn der Erkrankung wurde kürzlich dokumentiert, was auf eine mögliche Rolle dieses Immunzellkompartiments bei der Krankheitsauslösung hindeutet4. Der Erfolg von B-Zell-depletierenden Therapien wie monoklonalen Anti-CD20-Antikörpern bestätigt den mechanistischen Zusammenhang zwischen einer aberranten B-Zell-Funktion und der autoimmunen Demyelinisierung 5,6. Aus molekularer Sicht können B-Zellen über die Präsentation von Autoantigenen, die entzündungsfördernde Zytokinsekretion und die autoreaktive Antikörperproduktion zu Krankheiten beitragen.
Es wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um spezifische Merkmale des komplexen MS-Phänotyps zu rekapitulieren. Unter ihnen ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) das am weitesten verbreitete In-vivo-Paradigma und beruht auf der Immunisierung von Versuchstieren mit kurzen Peptiden, die von Myelinproteinen wie dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) und dem Myelin-Basisprotein (MBP) abgeleitet sind7. EAE-immunisierte Tiere entwickeln eine demyelinisierende Pathologie, die der MS in vielen Aspekten ähnelt, einschließlich einer robusten humoralen Reaktion gegen das enzephalitogene Peptid8. Aus diesem Grund haben EAE-Studien maßgeblich dazu beigetragen, die Funktion von B-Zellen und Autoantikörpern im Rahmen von Krankheiten zu entschlüsseln. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass MOG-spezifische Antikörper, die von MS-Patienten isoliert wurden, den klinischen Verlauf in EAE-Modellen verschlimmern können9. Insbesondere wurde gezeigt, dass der Prolinrest an Position 42 in humanem MOG entscheidend für die Bestimmung der Autoantikörper-Pathogenitätist 10. In jüngerer Zeit wurde festgestellt, dass MOG-spezifische Autoantikörper die Krankheit nicht nur fördern, indem sie den Myelinverlust vermitteln, sondern auch die Reaktivierung autoreaktiver T-Zellen im ZNS verstärken11.
Unter Berücksichtigung der Bedeutung von Antikörperreaktionen bei der ZNS-Autoimmunität wird in diesem Artikel ein ELISA-basiertes Protokoll zur effizienten Messung der Serumspiegel von autoreaktiven Antikörpern in C57BL/6J-Mäusen vorgestellt, die mit dem MOG35-55-Peptid immunisiert wurden. Im ersten Teil des Protokolls wird die Methode zur Serumgewinnung mittels intrakardialer Punktion beschrieben. Anschließend werden die Verfahren zur Einrichtung des ELISA-Assays und zur Erfassung der Daten detailliert beschrieben. Zuletzt wird die Datenanalyse und -interpretation diskutiert.
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Protocol
Alle Eingriffe mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit den experimentellen Richtlinien durchgeführt, die vom East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden weibliche Wildtyp-Mäuse vom Typ C57BL/6J im Alter von 8-10 Wochen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle). EAE wurde nach zuvor veröffentlichten Berichteninduziert 12,13,14.
1. Serum-Entnahme
- Die Versuchsmaus wird durch CO2 -Erstickung oder Isofluran-Überdosierung zum erforderlichen Zeitpunkt (gemäß institutionell anerkannten Protokollen) nach Induktion von EAE über MOG35-55-Immunisierung eingeschläfert.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Mäuse und die Zeitpunkte für die Serumentnahme können je nach Experiment variieren. - Nachdem das Fehlen von Vitalparametern durch Einklemmen der Zehen oder des Schwanzes bestätigt wurde, legen Sie die Maus in eine dorsale Liegeposition auf ein Präpariertablett und befestigen Sie die Gliedmaßen mit Stecknadeln oder Klebeband in Position. Richten Sie den Mauskörper auf die LED-Lichtquelle aus (siehe Materialtabelle), um den Brustkorb des Tieres zu beleuchten.
- Besprühen Sie das Mausfell mit 70%igem Ethanol und machen Sie mit der Dissektorschere einen Mittellinienschnitt von 3-4 cm entlang des Bauches vom Becken bis zum Xiphoid, wobei Sie darauf achten, Organe und größere Gefäße zu vermeiden (Abbildung 1A-C). Um den Eingriff zu erleichtern, greifen Sie mit der Pinzette die Haut über den Xiphoid-Prozess.
- Schneiden Sie das Zwerchfell seitlich durch und schneiden Sie dann den Brustkorb an beiden Seitenkanten mit der Federschere nach vorne, bis Sie vor dem Brustbein an der Mittellinie aufhören (Abbildung 1D). Falten Sie die Rippenklappe, die über dem Mauskopf erstellt wurde, um das Herz freizulegen (Abbildung 1E).
HINWEIS: Das Durchtrennen des Brustbeins sollte vermieden werden, da dies die an den Knochen angrenzenden Hauptbrustarterien schädigt und das Volumen des Blutes, das entnommen werden kann, verringert. - Führen Sie eine 25-G-Nadel, die mit einer 1-ml-Spritze verbunden ist, in den linken Ventrikel ein und sammeln Sie das Blut, indem Sie den Kolben vorsichtig zurückziehen (Abbildung 1F). Um die Nadelpunktion zu erleichtern, stützen Sie das Herz vorsichtig gegen eine Pinzette.
HINWEIS: Wenn das Blut nicht sofort in die Spritze eindringt, sollte die Nadel langsam gedreht und ein anderer Winkel getestet werden. Es sollten jedoch Anstrengungen unternommen werden, um die Nadel beim ersten Versuch richtig zu platzieren, um unnötige Löcher im Herzen zu vermeiden, aus denen Blut austreten kann. - Füllen Sie das Blut in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen und lassen Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerinnen. Entfernen Sie das Gerinnsel durch Zentrifugation bei 2000 × g für 20 min bei 4 °C. Sammeln Sie den Überstand, der die Serumfraktion darstellt, und lagern Sie Einweg-Aliquots in Kryoröhrchen bei -80 °C für zukünftige Tests.
2. ELISA-Assay
- Resuspendieren Sie das lyophilisierte MOG35-55-Peptid (siehe Materialtabelle) in Wasser, um eine Brühe von 10 mg/ml zu erhalten. Verdünnen Sie vor Beginn des Experiments den Stamm auf 10 μg/ml in Beschichtungspuffer (siehe Materialtabelle) und pipettieren Sie 100 μl/Vertiefung der endgültigen Lösung in eine 96-Well-Platte. Verschließen Sie die Platte mit einer Klebefolie, um eine Verdunstung zu vermeiden, und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 4 °C.
HINWEIS: Für jede Probe sollten mindestens 2 Wells berechnet werden, und 2 zusätzliche Wells sollten ebenfalls für eine Blindkontrolle einbezogen werden. - Parallel dazu wird die gleiche Anzahl von Vertiefungen mit 100 μl/Vertiefung Rinderserumalbumin (BSA) beschichtet, das in Beschichtungspuffer bei einer Konzentration von 10 μg/ml gelöst ist. Diese zusätzlichen Wells dienen als Hintergrundsteuerelemente.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kontrollvertiefungen mit BSA zu beschichten, da die Beschichtungs- und Blockierungspuffer unterschiedliche Zusammensetzungen haben. Bitte beachten Sie, dass andere enzephalitogene Peptide (wie PLP139-151 oder MBP84-104) als irrelevante Antigene als Alternative zu BSA verwendet werden können. - Waschen Sie die Platte am nächsten Tag 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung Phosphatpuffer-Kochsalzlösung, die mit 0,05 % Tween 20 (PBS-T) ergänzt wird. Anschließend werden 100 μl/Vertiefung einer Blockierungslösung aus 3 % BSA in PBS (ohne Tween 20) zugegeben und die Platte 1 h lang bei 37 °C in einem Hybridisierungsofen inkubiert.
- Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Verdünnen Sie jede Serumprobe 1:100 in Blockierungslösung und geben Sie 100 μl/Well in MOG35-55- und BSA-beschichtete Wells. Geben Sie das gleiche Volumen der Blockierungslösung in die Vertiefungen, die als Leerproben gekennzeichnet sind. Inkubieren Sie die Platte verschlossen für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (250 U/min).
- Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Verdünnen Sie den HRP-konjugierten Sekundärantikörper (1:2000, siehe Materialtabelle) in einer Lösung aus 0,2 % BSA in PBS-T und geben Sie 100 μl/Well in alle Wells. Inkubieren Sie die Platte verschlossen für 1 h bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln (250 U/min).
- Waschen Sie die Platte 3 Mal mit 200 μl/Vertiefung PBS-T. Geben Sie 100 μl/Vertiefung 3,3',5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat (siehe Materialtabelle) in alle Vertiefungen und inkubieren Sie 1-5 Minuten lang im Dunkeln, wobei Sie die Entwicklung einer blauen Farbe überwachen.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl/Vertiefung Stopplösung hinzufügen (siehe Materialtabelle) und messen Sie die optische Dichte (OD) in jeder Vertiefung mit einem Plattenlesegerät, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
HINWEIS: Das TMB-Substrat sollte 30-60 Minuten lang bei Raumtemperatur äquilibriert werden, bevor es in die Vertiefungen gegeben wird.
- Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 100 μl/Vertiefung Stopplösung hinzufügen (siehe Materialtabelle) und messen Sie die optische Dichte (OD) in jeder Vertiefung mit einem Plattenlesegerät, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
3. Datenanalyse
- Füllen Sie eine Excel-Tabelle mit den von der Platte gelesenen OD-Werten aus. Mittelwert der OD-Werte, die aus doppelten Vertiefungen (sowohl MOG35-55 als auch BSA-beschichtet) für jede Probe erhalten wurden.
- Subtrahieren Sie für jede Probe den Mittelwert der BSA-beschichteten Vertiefungen von dem der mit MOG35 bis 55 beschichteten Vertiefungen. Die resultierenden hintergrundkorrigierten Werte sind proportional zur Konzentration von Anti-MOG35-55-Antikörpern in den verschiedenen Serumproben.
HINWEIS: Leere Vertiefungen sollten zu korrigierten Werten um 0 führen. - Wenden Sie einen nicht-parametrischen statistischen Test an, z. B. den Mann-Whitney-U-Test, um die durchschnittlichen OD-Werte zwischen zwei experimentellen Bedingungen zu vergleichen. Fügen Sie mindestens 3 unabhängige Stichproben für jede Bedingung hinzu.
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Representative Results
Um die Robustheit des vorliegenden ELISA-Assays zu demonstrieren, wurde die Methode an Serumproben getestet, die aus einer Kohorte von weiblichen C57BL/6J-Mäusen 20 Tage nach der Immunisierung (dpi) mit 100 μg MOG35-55-Peptid in vollständigem Freund-Adjuvans (CFA) nach einem validierten EAE-Induktionsprotokollisoliert wurden 12,13,14. Die Tiere erhielten außerdem an Tag 0 und 2 400 ng Pertussis-Toxin. Als Negativkontrollen dienten Serumproben von scheinimmunisierten Tieren, die alles, aber ohne das Peptid hatten. Alle EAE-Mäuse entwickelten die ersten Krankheitszeichen zwischen 11 und 14 dpi und erreichten bei 20 dpi einen durchschnittlichen Wert von 2,6 ± 0,6 (Standardfehler, SE) auf einer Skala von 0 bis 6 (0, keine Anzeichen; 1, verminderter Schwanztonus; 2, leichte Monoparese oder Paraparese; 3, schwere Paraparese; 4 Querschnittslähmung; 5 Quadriparese; und 6, moribund oder Tod)12. Erwartungsgemäß wiesen die EAE-Proben im Vergleich zu Kontrollproben signifikant höhere OD-Werte auf (Abbildung 2). Diese Daten bestätigen das Vorhandensein einer robusten IgG-Immunglobulin-Antwort gegen das MOG-Peptid auf dem Höhepunkt der Erkrankung.
Abbildung 1: Herzpunktionsverfahren. (A-E) Repräsentative Bilder des Thorakotomieverfahrens für den Zugang zum Herzen bei erwachsenen Mäusen. (F) Repräsentatives Bild des korrekten Verfahrens zum Einstechen der Nadel in den linken Ventrikel des Mausherzens. In jeder Tafel sind relevante anatomische Strukturen angegeben, um die Dissektion zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: MOG-Peptid-Autoantikörper ELISA. Die Serumspiegel von Anti-MOG35-55-IgG-Immunglobulinen wurden an EAE- und Scheinimmunisierten Mäusen 20 Tage nach der Immunisierung (dpi) unter Verwendung des berichteten ELISA-Protokolls getestet. In EAE-Proben wurden durchweg höhere OD-Werte im Vergleich zu Kontrollen festgestellt. Die Daten werden als Mittelwerte ± SE dargestellt (N = 3 pro Gruppe). Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch einen einseitigen Mann-Whitney-U-Test bewertet, *P ≤ 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Hier wurde über ein einfaches und effizientes ELISA-basiertes Protokoll berichtet, um die humorale Reaktion in einem relevanten Tiermodell der MS-Pathologie genau zu quantifizieren. Diese Methode wurde kürzlich eingesetzt, um die neuartige Rolle des Ataxin-1-Proteins bei der Kontrolle der Serumspiegel von Autoantikörpern im MOG35-55/C57BL6J EAE-Paradigma12 zu beschreiben. In diesem Zusammenhang sollten eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden, um mit dieser Methode konsistente und biologisch aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten.
Erstens ist es entscheidend, qualitativ hochwertige Serumproben zu sammeln und eine Hämolyse zu vermeiden. Hämoglobin und andere intrazelluläre Komponenten, die von roten Blutkörperchen in stark hämolysierten Proben freigesetzt werden, können die Antigen-Antikörper-Reaktion und die relative Farbmessung im ELISA-Assay beeinträchtigen. Um eine Hämolyse zu verhindern, ist es vorzuziehen, einen hohen Unterdruck in der Spritze während der Blutentnahme zu vermeiden, da dies zum Bruch der Erythrozyten führen kann.
Zweitens ist es wichtig, die Serumproben zu verdünnen, um OD-Werte innerhalb des linearen Teils der Absorptionskurve zu erhalten. Unser empfohlener Verdünnungsfaktor (1:100) wurde auf die Entität der EAE-Pathologie kalibriert, die in unseren Mausstämmen induziert wurde. In Anbetracht der intrinsischen Heterogenität dieses In-vivo-Modells wird dringend empfohlen, vorläufige Titrationsexperimente durchzuführen, um den idealen Verdünnungsfaktor für die spezifische EAE-Pathologie zu identifizieren, die getestet wird. Ebenso können die Inkubationszeiten mit dem TMB-Substrat angepasst werden, um die Sättigung des chromogenen Signals zu vermeiden und die OD-Werte im Bereich von 0-2 zu halten.
Drittens sind die korrigierten OD-Werte, die in diesem Protokoll erhalten wurden, kompatibel mit einer semiquantitativen Analyse von Autoantikörper-Serumtitern zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen oder für kinetische Studien entlang des Krankheitsverlaufs. Wenn eine absolute Quantifizierung der Autoantikörperspiegel erforderlich ist, muss eine Kalibrierungskurve in das ELISA-Design implementiert werden. Mehrere Antikörper gegen das MOG-Peptid sind kommerziell erhältlich und können als zuverlässige Standards zur Berechnung der Konzentration von MOG-spezifischen Antikörpern im Serum von EAE-Mäusen verwendet werden. Um Effekte unterschiedlicher Größenordnung zu erfassen, wird empfohlen, eine breite Palette von Verdünnungen für den kalibrierenden Antikörper einzuschließen (von pg/ml- bis μg/ml-Konzentrationen).
Schließlich ist dieses Protokoll äußerst flexibel und kann leicht an unterschiedliche Forschungsanforderungen angepasst werden. Zum Beispiel kann das beschichtete enzephalitogene Peptid variiert werden, um die Autoantikörperantwort in anderen EAE-Paradigmen zu bewerten. Darüber hinaus können verschiedene Sekundärantikörper verwendet werden, um die Spiegel verschiedener Immunglobulinklassen zu messen. Zu diesem Zweck konnte mit diesem Protokoll erfolgreich nachgewiesen werden, dass Ataxin-1 sowohl die IgG- als auch die IgM-Klasse von MOG-Peptid-spezifischen Antikörpern kontrolliert12. Schließlich könnte eine mögliche Verwendung für den Nachweis von Autoantikörpern im Blut von MS-Patienten ins Auge gefasst werden. Es gibt jedoch erhebliche Unterschiede zwischen EAE- und MS-Erkrankungen. Während erstere künstlich induziert wird, indem die Immunantwort gegen ein genau definiertes Autoantigen mit starken Adjuvantien verstärkt wird, entsteht letztere spontan und es wurden noch keine eindeutigen Autoantigene identifiziert. Neuere Erkenntnisse deuten auf eine mögliche Beteiligung molekularer Mimikry an viralen Proteinenhin 15. Daher sollten bei der direkten Übertragung von Beobachtungen, die in diesem Tiermodell gesammelt wurden, auf die menschliche Krankheit immer Vorbehalte berücksichtigt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das vorliegende Protokoll eine einfache und bequeme Alternative zu kommerziellen ELISA-Kits darstellt und effizient mit anderen Methoden wie zellbasierten Assays (CBAs) kombiniert werden kann, um die genaue Abschätzung der Autoantikörperfreisetzung im Rahmen der Autoimmundemyelinisierung zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (R03NS131908) und dem Verteidigungsministerium im Rahmen des Multiple Sclerosis Research Program unter der Fördernummer W81XWH-22-1-0517 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Studie wurde auch von Startup-Fonds der East Carolina University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
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