Summary
Eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) er en dyremodell av multippel sklerose (MS), som deler med den menneskelige sykdommen en robust humoral autoimmun respons. Her rapporterer vi en enkel og fleksibel ELISA-protokoll for å kvantifisere autoantistoffer i serum hos EAE-immuniserte mus.
Abstract
Eksperimentell autoimmun encefalopati (EAE) er en sykdomsmodell som rekapitulerer den autoimmune sykdommen multippel sklerose (MS) på histopatologisk og molekylært nivå. EAE induseres ved immunisering av forsøksdyr via subkutan injeksjon av korte myelinpeptider sammen med spesifikke hjelpestoffer for å øke immunresponsen. Som den menneskelige motparten utvikler EAE-mus demyeliniserende lesjoner, immuncelleinfiltrasjon i sentralnervesystemet (CNS), gliaaktivering og nevronskade. En konsistent mengde bevis støtter også en mekanistisk rolle for B-celledysfunksjon i etiologien til både MS og EAE. B-celler kan tjene som antigenpresenterende celler, så vel som en primær kilde til proinflammatoriske cytokiner og autoantistoffer. I EAE genereres antistoffer mot myelinpeptidene som ble brukt til å indusere sykdommen. Slike autoantistoffer har vist seg å mediere enten myelintap eller patogen T-cellereaktivering i CNS. Denne artikkelen beskriver en effektiv ELISA-basert protokoll for å kvantifisere autoantistoffer i serum av C57BL / 6J-mus immunisert med myelinoligodendrocyttglykoprotein 35-55 (MOG35-55) peptid. Den foreslåtte metoden tjener som et kraftig verktøy for å undersøke spesifisiteten og størrelsen på den avvikende humorale responsen i sammenheng med autoimmun demyelinisering.
Introduction
Multippel sklerose (MS) er en kronisk autoimmun sykdom i sentralnervesystemet (CNS) preget av fokal infiltrasjon av immunceller i hjernens parenkym, nedbrytning av myelinskjeder, innpakningsaksoner, gliaaktivering og nevrontap1. I tillegg til den veletablerte rollen som patogene T-celler, har flere bevislinjer fremhevet involvering av B-celler i formidling av den autoimmune responsen mot CNS. B-celler gjennomgår klonal ekspansjon i MS-hjernen og antistoffer mot myelinkomponenter er påvist i demyeliniserte lesjoner 2,3. Den selektive aktiveringen av perifere B-celler ved sykdomsdebut er nylig dokumentert, noe som tyder på en antatt rolle for dette immuncellerommet i sykdomsinitiering også4. Suksessen til B-cellenedbrytende terapier som anti-CD20 monoklonale antistoffer bekrefter ytterligere den mekanistiske forbindelsen mellom avvikende B-cellefunksjon og autoimmun demyelinisering 5,6. Fra et molekylært synspunkt kan B-celler bidra til sykdom via autoantigenpresentasjon, proinflammatorisk cytokinsekresjon og autoreaktiv antistoffproduksjon.
Flere dyremodeller har blitt utviklet for å rekapitulere spesifikke egenskaper ved den komplekse MS-fenotypen. Blant dem er eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) det mest brukte in vivo-paradigmet og er avhengig av immunisering av forsøksdyr med korte peptider avledet fra myelinproteiner som myelinoligodendrocyttglykoprotein (MOG) og myelinbasisk protein (MBP)7. EAE-immuniserte dyr utvikler en demyeliniserende patologi som ligner MS i mange aspekter, inkludert en robust humoral respons mot encefalittogent peptid8. Av denne grunn har EAE-studier vært medvirkende til å dissekere funksjonen til B-celler og autoantistoffer i sammenheng med sykdom. For eksempel ble det demonstrert at MOG-spesifikke antistoffer isolert fra MS-pasienter kan forverre det kliniske forløpet i EAE-modeller9. Spesielt ble prolinresten i posisjon 42 i human MOG vist å være kritisk for bestemmelse av autoantistoffpatogenisitet10. Mer nylig har MOG-spesifikke autoantistoffer blitt funnet å fremme sykdom, ikke bare ved å formidle myelintap, men også ved å øke reaktiveringen av autoreaktive T-celler i CNS11.
Tatt i betraktning viktigheten av antistoffresponser ved CNS-autoimmunitet, presenterer denne artikkelen en ELISA-basert protokoll for effektivt å måle serumnivåene av autoreaktive antistoffer i C57BL/6J-mus EAE immunisert med MOG35-55-peptid. I første del av protokollen beskrives metoden for å samle serum via intrakardial punksjon. Deretter vil prosedyrene for å sette opp ELISA-analysen og skaffe dataene bli detaljert. Til slutt vil dataanalyse og tolkning bli diskutert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverte mus ble utført i samsvar med eksperimentelle retningslinjer godkjent av East Carolina University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wildtype C57BL/6J hunnmus mellom 8-10 ukers alder ble brukt i denne studien. Dyrene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). EAE ble indusert etter tidligere publiserte rapporter 12,13,14.
1. Serum-samling
- Avlive den eksperimentelle musen ved CO2 -kvelning eller overdosering av isofluran ved ønsket tidspunkt (etter institusjonelt godkjente protokoller) etter å ha indusert EAE via MOG35-55-immunisering.
MERK: Totalt antall mus og tidspunkter for seruminnsamling kan variere i henhold til det spesifikke eksperimentet. - Etter at fraværet av vitale tegn er bekreftet av tå eller haleklype, plasser musen i en dorsalliggende stilling på et disseksjonsbrett og fest lemmer på plass med pinner eller tape. Orienter musekroppen til LED-lyskilden (se materialfortegnelse) for å belyse dyrets thorax.
- Spray musepelsen med 70% etanol og gjør et midtlinjesnitt på 3-4 cm langs magen fra bekkenet til xiphoid ved hjelp av dissektorsaksen, pass på å unngå organer og store kar (figur 1A-C). For å lette prosedyren, bruk tangen til å gripe huden over xiphoidprosessen.
- Skjær gjennom mellomgulvet sideveis og klipp deretter brystkassen anteriort på begge sidekanter ved hjelp av fjærsaksen, stopp før du når brystbenet ved midtlinjen (figur 1D). Brett ribbelappen som ble opprettet over musehodet for å eksponere hjertet (figur 1E).
MERK: Kutting av brystbenet bør unngås, da dette vil skade de viktigste thoraxarteriene som ligger ved siden av beinet og redusere volumet av blod som kan samles. - Stikk en 25 G kanyle koblet til en 1 ml sprøyte inn i venstre ventrikkel og samle opp blodet ved å trekke stempelet forsiktig tilbake (figur 1F). For å lette nålepunkteringen, spenne hjertet forsiktig mot et par tang.
MERK: Hvis blodet ikke kommer umiddelbart til syne i sprøyten, skal nålen roteres sakte, og en annen vinkel skal testes. Imidlertid bør det tilstrebes å plassere nålen riktig ved første forsøk for å unngå å skape unødvendige hull i hjertet der blod kan lekke ut. - Overfør blodet til et sterilt 1,5 ml rør og la det koagulere i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern blodproppen ved sentrifugering ved 2000 × g i 20 minutter ved 4 °C. Samle supernatanten, som representerer serumfraksjonen, og oppbevar engangsalikoter i kryogene rør ved -80 °C for fremtidig testing.
2. ELISA-analyse
- Resuspender det lyofiliserte MOG35-55-peptidet (se materialfortegnelse) i vann for å oppnå en 10 mg/ml stam. Før eksperimentet starter, fortynn stammaterialet til 10 μg/ml i beleggbuffer (se materialtabell) og pipett 100 μL/brønn av den endelige løsningen til en 96-brønnsplate. Forsegl platen med en selvklebende film for å unngå fordampning og inkuber platen over natten ved 4 °C.
MERK: Minst 2 brønner skal beregnes for hver prøve og 2 ekstra brønner bør også inkluderes for en blank kontroll. - Parallelt belegger du samme antall brønner med 100 μL/brønn bovint serumalbumin (BSA) oppløst i beleggbuffer ved 10 μg/ml konsentrasjon. Disse ekstra brønnene vil fungere som bakgrunnskontroller.
MERK: Det anbefales å belegge kontrollbrønnene med BSA, siden belegg- og blokkeringsbufferne har forskjellige sammensetninger. Vær oppmerksom på at andre encefalittogene peptider (som PLP139-151 eller MBP84-104) kan brukes som irrelevante antigener i alternativ til BSA. - Dagen etter vaskes platen 3 ganger med 200 μL/brønn fosfatbuffersaltvann tilsatt 0,05% Tween 20 (PBS-T). Deretter tilsettes 100 μL / brønn av en blokkeringsløsning laget av 3% BSA i PBS (uten Tween 20) og inkuber platen forseglet i 1 time ved 37 ° C i en hybridiseringsovn.
- Vask platen 3 ganger med 200 μL/brønn PBS-T. Fortynn hver serumprøve 1:100 i blokkeringsløsning og tilsett 100 μL/brønn til både MOG35-55 og BSA-belagte brønner. Legg til samme volum av blokkeringsløsning til brønnene som er betegnet som emner. Inkuber platen forseglet i 2 timer ved romtemperatur, med konstant risting (250 o / min).
- Vask platen 3 ganger med 200 μL/brønn PBS-T. Fortynn det HRP-konjugerte sekundære antistoffet (1:2000, se materialfortegnelse) i en oppløsning laget av 0,2 % BSA i PBS-T og tilsett 100 μL/brønn til alle brønner. Inkuber platen forseglet i 1 time ved romtemperatur, med konstant risting (250 o / min).
- Vask platen 3 ganger med 200 μL/brønn PBS-T. Tilsett 100 μL / brønn med 3,3',5,5' tetrametylbenzidin (TMB) substrat (se materialtabell) til alle brønnene og inkuber i mørket i 1-5 minutter, og følg utviklingen av en blå farge.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 μL/brønn med stoppløsning (se materialliste) og måle den optiske tettheten (OD) i hver brønn ved hjelp av en plateleser satt til en bølgelengde på 450 nm.
MERK: TMB-substratet skal likevektes ved romtemperatur i 30-60 minutter før det legges til brønnene.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 μL/brønn med stoppløsning (se materialliste) og måle den optiske tettheten (OD) i hver brønn ved hjelp av en plateleser satt til en bølgelengde på 450 nm.
3. Dataanalyse
- Fyll ut et Excel-regneark med OD-verdiene lest fra platen. Gjennomsnitt OD-verdiene hentet fra dupliserte brønner (både MOG35-55 og BSA-belagt) for hver prøve.
- For hver prøve, trekk middelverdien av BSA-belagte brønner fra MOG35-55-belagte brønner. De resulterende bakgrunnskorrigerte verdiene vil være proporsjonale med konsentrasjonen av anti-MOG35-55-antistoffer i de forskjellige serumprøvene.
MERK: Tomme brønner skal gi korrigerte verdier rundt 0. - Bruk en ikke-parametrisk statistisk test som Mann-Whitney U-testen for å sammenligne gjennomsnittlige OD-verdier mellom to eksperimentelle forhold. Inkluder minst 3 uavhengige prøver for hver tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere robustheten til den nåværende ELISA-analysen ble metoden testet på serumprøver isolert fra en kohort av C57BL/6J hunnmus ved 20 dager etter immunisering (dpi) med 100 μg MOG35-55 peptid i komplett Freunds adjuvans (CFA) etter en validert EAE-induksjonsprotokoll 12,13,14. Dyrene fikk også 400 ng kikhostetoksin på dag 0 og 2. Serumprøver fra mock immuniserte dyr med alt, men uten peptidet, tjente som negative kontroller. Alle EAE-mus utviklet de første tegn på sykdom mellom 11-14 dpi og nådde med 20 dpi en gjennomsnittlig score på 2,6 ± 0,6 (standardfeil, SE) på en skala fra 0-6 (0, ingen tegn; 1, redusert haletone; 2, mild monoparesis eller paraparesis; 3, alvorlig paraparesis; 4, paraplegi; 5, quadriparesis; og 6, døende eller død)12. Som forventet viste EAE-prøvene signifikant høyere OD-verdier sammenlignet med kontrollprøver (figur 2). Disse dataene bekrefter tilstedeværelsen av en robust IgG-immunoglobulinrespons mot MOG-peptidet på toppen av sykdommen.
Figur 1 Prosedyre for hjertepunksjon. (A-E) Representative bilder av torakotomi-prosedyren for å få tilgang til hjertet hos voksne mus. (F) Representativt bilde av korrekt prosedyre for nålestikk i venstre ventrikkel i musehjertet. Relevante anatomiske strukturer er angitt i hvert panel for å lette disseksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MOG peptid autoantistoff ELISA. Serumnivåer av anti-MOG35-55 IgG-immunglobuliner ble testet i EAE og spotte immuniserte mus 20 dager etter immunisering (dpi) ved bruk av den rapporterte ELISA-protokollen. Konsekvent høyere OD-verdier ble detektert i EAE-prøver sammenlignet med kontroller. Data er presentert som gjennomsnitt ± SE (N = 3 per gruppe). Forskjeller mellom gruppene ble vurdert med ensidig Mann-Whitney U-test, *P ≤ 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ble en enkel og effektiv ELISA-basert protokoll rapportert for å kvantifisere den humorale responsen nøyaktig i en relevant dyremodell av MS-patologi. Denne metoden har nylig blitt brukt til å beskrive den nye rollen til ataxin-1-proteinet i å kontrollere serumnivåene av autoantistoffer i MOG35-55/C57BL6J EAE-paradigmet12. I denne forbindelse bør en rekke faktorer tas i betraktning for å oppnå konsistente og biologisk meningsfulle resultater med denne metoden.
For det første er det avgjørende å samle serumprøver av høy kvalitet og unngå hemolyse. Hemoglobin og andre intracellulære komponenter frigjort fra røde blodlegemer i tungt hemolyserte prøver kan forstyrre antigen-antistoffreaksjonen og relativ fargemåling i ELISA-analysen. For å forhindre hemolyse er det å foretrekke å unngå høyt undertrykk i sprøyten under blodinnsamling, da dette kan føre til at erytrocytter brister.
For det andre er det viktig å fortynne serumprøvene for å oppnå OD-verdier innenfor den lineære delen av absorbanskurven. Vår anbefalte fortynningsfaktor (1:100) ble kalibrert på enheten av EAE-patologien indusert i våre musestammer. Tatt i betraktning det iboende nivået av heterogenitet av denne in vivo-modellen , anbefales det sterkt å utføre innledende titreringseksperimenter for å identifisere den ideelle fortynningsfaktoren for den spesifikke EAE-patologien som testes. På samme måte kan inkubasjonstidene med TMB-substratet justeres for å unngå metning av det kromogene signalet og opprettholde OD-verdiene innenfor 0-2-området.
For det tredje er de korrigerte OD-verdiene oppnådd i denne protokollen kompatible med en semi-kvantitativ analyse av autoantistoff serumtitere mellom forskjellige eksperimentelle tilstander eller for kinetiske studier langs sykdomsprogresjon. Hvis en absolutt kvantifisering av autoantistoffnivåene er nødvendig, må en kalibreringskurve implementeres i ELISA-designet. Flere antistoffer mot MOG-peptid er kommersielt tilgjengelige og kan brukes som pålitelige standarder for å beregne konsentrasjonen av MOG-spesifikke antistoffer i serum fra EAE-mus. For å fange opp effekter av ulik størrelsesorden anbefales det å inkludere et bredt spekter av fortynninger for kalibreringsantistoffet (fra pg/ml til μg/ml konsentrasjoner).
Til slutt er denne protokollen ekstremt fleksibel og kan enkelt tilpasses for å imøtekomme ulike forskningsbehov. For eksempel kan det belagte encefalittogene peptidet varieres for å vurdere autoantistoffresponsen i andre EAE-paradigmer. Videre kan forskjellige sekundære antistoffer anvendes for å måle nivåene av forskjellige immunglobulinklasser. For dette formål viste denne protokollen vellykket at ataxin-1 kontrollerer både IgG- og IgM-klasser av MOG-peptidspesifikke antistoffer12. Til slutt kan det tenkes en mulig bruk for å oppdage autoantistoffer i blodet til MS-pasienter. Det er imidlertid betydelige forskjeller mellom EAE- og MS-sykdommer. Mens førstnevnte kunstig induseres ved å øke immunresponsen mot et veldefinert autoantigen med sterke adjuvanser, oppstår sistnevnte spontant og ingen entydige autoantigener er identifisert ennå. Nylige bevis tyder på mulig involvering av molekylær etterligning med virale proteiner15. Derfor bør forbehold alltid vurderes ved direkte oversettelse av observasjoner samlet inn i denne dyremodellen til den menneskelige sykdommen.
Oppsummert representerer den nåværende protokollen et enkelt og praktisk alternativ til kommersielle ELISA-sett og kan effektivt kombineres med andre metoder som cellebaserte analyser (CBA) for presis estimering av autoantistofffrigivelse i sammenheng med autoimmun demyelinisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (R03NS131908) og Department of Defense gjennom Multiple Sclerosis Research Program under Award No. W81XWH-22-1-0517. Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er forfatterens og er ikke nødvendigvis godkjent av Forsvarsdepartementet. Denne studien ble også støttet av East Carolina University oppstartsfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309628 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 25 G needles | BD Biosciences | 305122 | |
| 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) substrate | Thermo Fisher | N301 | Store at 4 °C |
| Adhesive seals | Thermo Fisher | AB0558 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | Store at 4 °C |
| C57BL/6J female mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments |
| Cryogenic tubes | Fisher | 10-500-25 | |
| Dissection tray | Fisher | S111022 | |
| Dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| ELISA coating buffer | BioLegend | 421701 | Store at 4°C |
| Excel software | Microsoft | Analysis spreadsheet | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP | SouthernBiotech | 1030-05 | Store at 4 °C |
| LED light source | Fisher | AMPSILED21 | |
| Microplate reader | Fisher | 14-377-575 | |
| Molecular biology grade water | Corning | 46-000-Cl | |
| Mouse MOG35-55 peptide | EZBiolab | cp7203 | Store at -80 °C |
| Multichannel pipette | Axygen | AP-12-200-P | |
| Noyes spring scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Nunc MaxiSorp 96-well plates | BioLegend | 423501 | |
| Orbital shaker | Fisher | 88-861-023 | |
| Oven | VWR | 445-0024 | |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Refrigerated tabletop centrifuge | Thermo Fisher | 75002441 | |
| Stop solution | Thermo Fisher | N600 | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1706531 |
References
- Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A.
- Baranzini, S. E., et al. B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions. J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).
- Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis. Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).
- Ma, Q., et al. Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).
- Hauser, S. L., et al. Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).
- Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis. N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).
- Didonna, A. Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies. Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).
- Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).
- Khare, P., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model. J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).
- Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).
- Flach, A. C., et al. Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).
- Didonna, A., et al. Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).
- Didonna, A., et al. Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation. J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).
- Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).
- Lanz, T. V., et al. Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam. Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).
