इम्यूनोस्टेपिंग के लिए फिक्स्ड ड्रोसोफिला ओसाइट्स की तैयारी: बाहरी झिल्ली को ठीक करने और हटाने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि

Overview

ड्रोसोफिला देर से चरण के ओसाइट्स का इम्यूनोस्टेटिंग ओसाइट्स के आसपास की झिल्ली के कारण चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। यह वीडियो ओसाइट्स प्राप्त करने, उनके निर्धारण और इम्यूनोदाता के लिए झिल्ली को हटाने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट विधि का वर्णन करता है। विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल इन तकनीकों को दर्शाता है जिसमें देर से चरण के ओसाइट्स का उपयोग मेयोसिस के विभिन्न चरणों की कल्पना करने के लिए किया जाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल रेडफोर्ड और मैककिम, इमेजिंग प्रोमेटाफेज के लिए तकनीक और फिक्स्ड ड्रोसोफिला ओसाइट्स, जे विस एक्सपीमें मेयोसिस I के मेटाफेज से कुछ अंश है। (2016).

नोट: प्रक्रियाओं कमरे के तापमान पर किया जाता है जब तक कि अन्यथा उल्लेख नहीं किया जाता है। तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर का उपयोग फ्लाई पालन के लिए तापमान बनाए रखने और अन्यथा नोट न होने तक पार करने के लिए किया जाता है।

1. तैयारी

1. मक्खियों को तैयार करें।
   1. प्रोमेटाफेज-समृद्ध ओसाइट संग्रह।
      1. स्पष्ट वयस्क स्वस्थ, युवा स्टॉक या क्रॉस संस्कृतियों से उड़ता है। 25 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उम्र की बोतलें।
         नोट: आम तौर पर, दो स्वस्थ बोतलें पर्याप्त होंगी, हालांकि कुछ क्रॉस संस्कृतियों के लिए अधिक की आवश्यकता हो सकती है।
      2. दो दिनों के बाद, बोतलों से ~ 100 से 300 महिलाओं (जो इस बिंदु पर 0 से 2 दिन पुराने हैं) एकत्र करें। मादाओं को कुंवारी होने की आवश्यकता नहीं है। एक शीशी के पक्ष में खमीर पेस्ट का एक थपका जोड़ें और 30 महिलाओं और 10 से 15 पुरुषों को खमीर की शीशियों में रखें। 25 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए उम्र की शीशियां।
   2. मेटाफेज-समृद्ध ओसाइट संग्रह।
      1. स्टॉक या क्रॉस संस्कृतियों से ~ 100 से 300 महिलाओं को इकट्ठा करें। एक शीशी के पक्ष में खमीर पेस्ट का एक थपका जोड़ें और खमीर की शीशियों में 30 महिलाओं को (कोई पुरुषों के साथ जोड़ा) रखें। 25 डिग्री सेल्सियस पर तीन से पांच दिनों के लिए आयु शीशियों।
2. समाधान तैयार करें।
   नोट: समाधान कमरे के तापमान पर अनिश्चित काल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है, जब तक कि अन्यथा नोट न किया जाए।
   1. संशोधित रॉब का बफर (5x): 500 mM HEPES, 500 mm सुक्रोज, 275 m सोडियम एसीटेट, 200 m m पोटेशियम एसीटेट, 50 m M ग्लूकोज, 6 एमएम मैग्नीशियम क्लोराइड, और 5 एमएम कैल्शियम क्लोराइड तैयार करें। पीएच को 7.4 तक लाने के लिए 10 एन 11:8 सोडियम हाइड्रोक्साइड: पोटेशियम हाइड्रोक्साइड का उपयोग करें। निस्पंदन द्वारा स्टरलाइज; ऑटोक्लेव न करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गल के रूप में 1x है रॉब प्रति oocyte प्रस्तुत करने के ~ 200 मिलीलीटर तैयार करने की जरूरत है.
   2. फिक्सेशन समाधान।
      1. विकल्प #1: फॉर्मलडिहाइड/हेप्टेन फिक्सेशन तैयार करें । फिक्सेशन बफर तैयार करें: 1x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) प्लस 150 mM सुक्रोज। उपयोग करने के लिए, 687.5 माइक्रोन फिक्सेशन बफर और 312.5 माइक्रोन 16% फॉर्मलडिहाइड प्रति ओसाइट प्रेप के साथ ताजा करें।
         सावधानी: एक धुएं हुड में फॉर्मलडिहाइड समाधान का उपयोग करते समय दस्ताने पहनें। संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार कचरे का निस्तारण करें।
      2. विकल्प #2: फॉर्मलडिहाइड/कैकोडिलेट निर्धारण तैयार करें । फिक्स मिक्स तैयार करें: 250 mm सुक्रोज, 100 mm पोटेशियम एसीटेट (पीएच 7.5), 25 एमएम सोडियम एसीटेट (पीएच 7.0), और 25 एमएम ईजीटीए (पीएच 8.0)। उपयोग करने के लिए, 400 माइक्रोन फिक्स मिक्स, 100 माइक्रोन पोटेशियम कैकोडिल (1 एम, पीएच 7.2) और 500 माइक्रोन 16% फॉर्मलडिहाइड प्रति ओसाइट प्रेप के साथ ताजा करें।
         सावधानी: पोटेशियम कैकोडिलेट में आर्सेनिक होता है।
   3. पीबीएस/ट्राइटन एक्स-100 तैयार करें: 1x पीबीएस प्लस 1% या 0.05% ट्राइटन एक्स-100। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
   4. पीबीएस-ट्वीन 20-गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) (पीटीबी): 1x पीबीएस, 0.5% बीएसए (w/v), और 0.1% ट्वीन-20 तैयार करें। एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. देर से मंच ड्रोसोफिला Oocytes का संग्रह

1. झिल्ली के साथ ड्रोसोफिला ओसाइट्स के रूप में बरकरार प्लास्टिक और ग्लास से चिपके रहेंगे, एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के अंदर प्री-कोट और पीटीबी के साथ एक पाश्चर पिपेट प्रति ओसाइट प्रेप।
2. कार्बन डाइऑक्साइड के साथ सभी ~ 100 से 300 खमीर मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और ~ 100 मिलीलीटर 1x रॉब के बफर वाले ब्लेंडर में जोड़ें। पल्स तीन बार (~ 1 सेकंड प्रत्येक) । सक्रियण से बचने के लिए रॉब के लिए & 20 मिनट में oocytes रखें ।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, ओसाइट्स महिलाओं से हाथ से विच्छेदित हो सकते हैं। इस विधि का लाभ यह है कि इसके लिए कम महिलाओं की आवश्यकता होती है। हालांकि, हाइपोक्सिया से जुड़ी कलाकृतियों से बचने के लिए कार्बन डाइऑक्साइड के संपर्क को केवल कुछ मिनट तक सीमित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
3. बड़े जाल (~ 1,500 माइक्रोन) के माध्यम से 250 मिलीलीटर बीकर में बड़े शरीर के अंगों को हटाने के लिए फ़िल्टर करें। यदि कई बरकरार पेट जाल पर रहते हैं, तो अतिरिक्त रॉब के बफर का उपयोग करके सामग्री को फिर से पीसें, और फिर से फ़िल्टर करें। ~ 2 मिनट व्यवस्थित करें, फिर शीर्ष परत से ऊपर की परत को हटा दें, जितना संभव हो उतने बड़े शरीर के अंगों को हटा दें।
4. 250 मिलीलीटर बीकर में छोटे जाल (~ 300 माइक्रोन) के माध्यम से फ़िल्टर करें। अतिरिक्त रॉब और लेपित पाश्चुर पिपेट का उपयोग करके पहले बीकर से शेष ओसाइट्स कुल्ला। ~ 3 मिनट व्यवस्थित करते हैं; ऊसाइट्स बाहर बसने जाएगा। सभी लेकिन ~ 10 मिलीलीटर से आकांक्षी।
5. 10 मिलीलीटर के रूप में ज्यादा डालो के रूप में लेपित 5 मिलीलीटर ट्यूब में फिट होगा। बसने दें, तरल निकालें, और शेष के साथ दोहराएं। अतिरिक्त रॉब और लेपित पाश्चर पिपेट का उपयोग करके बीकर से शेष ओसाइट्स को कुल्ला करें। ~ 3-5 मिनट के लिए 5 मिलीलीटर ट्यूब में व्यवस्थित होने दें।

3. दवा उपचार (वैकल्पिक)

1. प्रत्येक oocyte प्रस्तुत करने के लिए पीटीबी के साथ एक दूसरे 5 मिलीलीटर ट्यूब कोट। प्रत्येक oocyte प्रस्तुत करने(तालिका1) के लिए 1 मिलीलीटर रॉब के प्रत्येक में उपयुक्त सॉल्वेंट (नियंत्रण) या दवा जोड़ें।
2. दूसरे लेपित 5 मिलीलीटर ट्यूब में oocytes विभाजित करें। बसने दें, तरल निकालें, और एक ट्यूब में 1 मिलीलीटर रॉब के प्लस सॉल्वेंट और दूसरी ट्यूब में 1 एमएल रॉब की प्लस दवा जोड़ें। दवा उपचार के लिए उचित समय के लिए Nutate(तालिका 1)। बसने दीजिए।

4. निर्धारण

1. सभी तरल को बंद करें और तुरंत 1 मिलीलीटर फिक्स जोड़ें।
2. विकल्प #1: फॉर्मलडिहाइड/हेप्टेन फिक्सेशन (फिक्सेशन बफर प्लस 5% फॉर्मलडिहाइड)।
   1. एक न्यूट्राटर पर 2.5 मिनट के लिए ठीक करें। 1 मिलीलीटर हेप्टेन और भंवर 1 मिनट जोड़ें। ~ 1 मिनट व्यवस्थित करते हैं।
   2. सभी तरल निकालें, और फिर 1 मिलीलीटर 1x PBS जोड़ें। भंवर 30 सेकंड। ~ 1 मिनट व्यवस्थित करते हैं।
   3. सभी तरल निकालें, और फिर 1x PBS के साथ ट्यूब भरें।
      नोट: Oocytes तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए nutator पर रखा ।
3. विकल्प #2: फॉर्मलडिहाइड/कैकोडिलेट फिक्सेशन (फिक्स मिक्स प्लस 8% फॉर्मलडिहाइड और 100 एमएम कैकोडिलेट)।
   1. एक नटेटर पर 6 मिनट के लिए ठीक करें। 2 मिनट व्यवस्थित होने दें। तरल निकालें, और फिर 1x PBS के साथ ट्यूब भरें।
      नोट: Oocytes तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या कमरे के तापमान पर कई घंटे के लिए nutator पर रखा ।

5. झिल्ली को हटाना ("रोलिंग")

1. लेपित पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, ग्लास स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए (रेत-नष्ट) भाग में ~ 500 से 1,000 ओसाइट्स जोड़ें। शरीर के सभी अंगों और बाहरी सामग्री को संदंश का उपयोग करके हटा दें। ओसाइट्स को सूखने न दें; आवश्यक के रूप में 1x पीबीएस जोड़ें।
2. ओसाइट्स के शीर्ष पर एक कवरलिप रखें और धीरे-धीरे "रोल" ओसाइट्स जब तक सभी झिल्ली हटा दिए जाते हैं (ओसाइट्स में कवरस्लिप के किनारे को खींचना सबसे अच्छा काम करता है)। समय-समय पर माइक्रोस्कोप के तहत प्रगति की जांच करें, आवश्यकतानुसार अधिक 1x पीबीएस जोड़ें। ध्यान रखें क्योंकि बहुत अधिक दबाव ओसाइट्स को नष्ट कर देगा।

Representative Results

दवा	विलायक	स्टॉक एकाग्रता	अंतिम एकाग्रता	उपचार का समय	सामान
कोल्चिसिन	एथनॉल	125 mM	150 माइक्रोन	10 मिनट या 30 मिनट	गैर-किनेटोकोर को अस्थिर करें (10 मिनट) या सभी (30 मिनट) माइक्रोट्यूबुल्स
तापलिटैक्सेल	डीएमएसओ	10 mm	10 माइक्रोन	10 मिनट	माइक्रोट्यूबुल्स को स्थिर करना
बिन्यूक्लिन 2	डीएमएसओ	25 एमएमएम	25 माइक्रोन	20 मिनट	अरोड़ा बी किनेज़ को रोकें

तालिका 1: दवा उपचार।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% formaldehyde	Ted Pella, Inc.	18505	HAZARDOUS; once opened, discard after one month
250 ml beakers	Various
5 ml tubes	Various
active dry yeast	Various		mix with water to make a paste the consistency of peanut butter
Binucleine 2	Sigma	B1186	HAZARDOUS
blender	Various
bovine serum albumin	Sigma	A4161
calcium chloride	Various
colchicine	Sigma	C-9754	HAZARDOUS
coverslips	VWR	48366-227	No. 1 1/2
DMSO	Various
EGTA	Various
ethanol	Various
forceps	Ted Pella, Inc.	5622	Dumont tweezers high precision grade style 5
glass slides	VWR	48312-003
glucose	Various
HEPES	VWR	EM-5330	available from several venders
magnesium chloride	Various
large mesh (~1,500 µm)	VWR	AA43657-NK	variety of formats and other suppliers, 12 or 14 mesh
small mesh (~300 µm)	Spectrum labs	146 424	variety of formats, e.g., 146 422 or 146 486
nutator	Various
Pasteur pipets	Various
potassium acetate	Various
Cacodylic acid	Sigma	C0125	HAZARDOUS; alternatively, sodium cacodylate may be substituted
potassium hydroxide	Various
sodium acetate	Various
sodium hydroxide	Various
sucrose	Various
taxol (paclitaxel)	Sigma	T1912	HAZARDOUS
Triton X-100	Fisher	PI-28314
Tween 20	Fisher	PI-28320
vortex	Various