Le poisson zèbre représente un précieux modèle pour étudier les mécanismes de la régénération cardiaque chez les vertébrés. Ici, nous présentons un protocole pour l'induction d'un infarctus cardiaque chez le poisson zèbre adulte en utilisant cryoinjury. Cette méthode aboutit à une mort cellulaire massive au sein de 20% de la paroi ventriculaire, similaire à celle observée dans les infarctus de mammifères.
Le coeur de mammifère est incapable de régénération importante suite à une blessure aiguë comme un infarctus du myocarde 1. En revanche, les amphibiens urodèles et les poissons téléostéens conserver une capacité remarquable pour la régénération cardiaque avec peu ou pas de cicatrices long de la vie 2,3. On ne sait pas pourquoi seuls certains vertébrés non mammifères peuvent recréer un organe complet, à partir de tissus résiduels 4,5. Pour comprendre les différences moléculaires et cellulaires entre des réactions de régénération des espèces différentes, nous avons besoin d'utiliser des approches similaires pour induire les lésions aiguës.
Chez les mammifères, le modèle le plus fréquemment utilisé pour étudier la réparation cardiaque a été une ischémie aiguë après une ligature de l'artère coronaire ou la destruction des tissus après cryoinjury 6,7. La régénération cardiaque chez les tritons et de poisson-zèbre a été principalement étudiée après une résection partielle de l'apex du ventricule 2,3. Récemment, plusieurs groupes ont établished la technique cryoinjury à 8-10 poisson zèbre adulte. Cette méthode a un grand potentiel, car elle permet une discussion comparative des résultats obtenus à partir des espèces de mammifères et non mammifères.
Ici, nous présentons une méthode pour induire une reproductible en forme de disque infarctus du ventricule poisson zèbre par cryoinjury. Ce modèle est basé sur des blessures rapide de congélation-décongélation des tissus, ce qui entraîne une mort cellulaire massive d'environ 20% des cardiomyocytes de la paroi ventriculaire. Tout d'abord, une petite incision a été faite à travers la poitrine avec des ciseaux iridectomie pour accéder au cœur. La paroi ventriculaire a été directement congelé en appliquant des 23-25 secondes, un cryosonde acier inoxydable prérefroidi dans l'azote liquide. Pour arrêter la congélation de l'eau du poisson cœur, à la température ambiante a été larguée sur la pointe de la sonde cryogénique. La procédure est bien tolérée par les animaux, avec un taux de survie de 95%.
Afin de caractériser le processus de régénération, les cœurs étaientprélevés et fixés à des jours différents après cryoinjury. Par la suite, l'échantillon ont été embarqués pour cryosectioning. Les diapositives avec des sections ont été traitées pour l'analyse histologique, l'hybridation de situ et d'immunofluorescence. Cet engagement renforce notre compréhension des facteurs qui sont nécessaires pour la plasticité de régénération chez le poisson zèbre, et de fournir de nouveaux aperçus sur les mécanismes de la régénération cardiaque. Une compréhension conceptuelle et moléculaire de la régénération cardiaque chez le poisson zèbre aura un impact à la fois la biologie du développement et de la médecine régénérative.
Cryoinjury est défini comme le dommage contrôlée de tissu par l'application précise de 14 froid. Direct choc thermique détruit les cellules par la destruction des protéines et par la formation de glace intracellulaire de cristal liquide qui rompt la membrane plasmique. Par conséquent, les cellules lésées meurent dans les processus de l'apoptose et la nécrose 14. Ces deux mécanismes de mort cellulaire a été démontré que de contribuer à la perte de tissu après un infarctus du myocarde 15. Ainsi, cryoinjury représente un modèle approprié d'induire un infarctus cardiaque. Plusieurs études ont rapporté cette méthode bien prouvé dans divers mammifères, y compris les souris, rats, lapins et porcs 6,7. L'adaptation du protocole cryoinjury chez le poisson zèbre permet une discussion plus comparative sur la réponse du myocarde entre les différentes espèces.
Deux autres groupes développés de façon indépendante la procédure cryoinjury pour le cœur du poisson zèbre adulte. Les principales différences sont la surméthodes chirurgie, le type d'outils et appliquée temps de congélation. Dans l'étude de González-Rosa et al., Le péricarde a été ouverte par la déchirure du tissu au lieu de couper. Ils ont utilisé 0,3 mm filament de cuivre relié à un tube de polyamide pré-refroidi dans l'azote liquide pour geler le cœur pendant quelques secondes jusqu'à ce que le dégel a pu être observée 10. Dans l'étude de Schnabel et al., Une pièce conique de la glace sèche de 20 mm de longueur avec une pointe de 2 mm dans son diamètre a été utilisé pour toucher le cœur pendant 10 secondes 8. Les deux groupes obtenu dommages ventriculaire par la mort du myocarde. L'avantage de notre méthode est un dépôt plus reproductible de riche en collagène cicatriciel, qui imite mieux les premières réponses de guérison infarctus observés dans les systèmes mammaliens.
L'étape critique lors de la procédure cryoinjury chez le poisson zèbre est une incision à travers la peau et le péricarde sans perforer le coeur sous-jacente. Un correctement performela chirurgie d provoque des saignements peu. Saignement abondant indique une ponction accidentelle du ventricule avec des ciseaux. Dans de tels cas, les animaux doivent être rentrés de l'expérience. Pour éviter de percer le cœur, le point de ciseaux doit être destiné à un angle faible de la peau.
Un autre aspect important pour la création d'une blessure reproductible est le positionnement exact de la cryosonde froid sur le ventricule pendant la durée optimale précise. Trop court temps de congélation se traduira par une inflammation à la mort cellulaire peu. Congélation prolongée, d'autre part, peut causer des dommages importants du cœur, ce qui peut conduire à une mortalité accrue des animaux. Nous avons déterminé que le meilleur moment pour tenir le ventricule dans les gammes de l'état congelé entre 23-26 secondes pour un 2 cm de long poisson zébré adulte, et peuvent donc différer dépendamment de la taille des animaux.
Parce que notre protocole est très simple et rapide, il n'ya pas de limite expérimentaletions à soumettre un nombre suffisant d'animaux pour obtenir des réplications biologiques adéquats. Le traitement de cryochirurgie est très bien tolérée par les animaux. Collection des cœurs à différents moments après cryoinjury permet la caractérisation détaillée des phases ultérieures au cours du processus de régénération. L'analyse expérimentale des coeurs cryoinjured peut comprendre 1) visualisation de la transcription des gènes par hybridation in situ, 2) la détection de la distribution des protéines par immunofluorescence, 3) l'imagerie histologique des structures différentes. Comprendre les processus de guérison clés après un infarctus du myocarde chez le poisson zèbre aura un impact sur le domaine de la biologie régénérative. En outre, il pourrait être bénéfique pour la conception de nouvelles approches thérapeutiques en médecine régénérative.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier V. Zimmermann pour l'assistance technique excellente et pour les soins de poissons. Ce travail a été soutenu par le Fonds national suisse de la science, numéro d'obtention: 310000_120611.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |