Индукции инфаркта миокарда у взрослых данио рерио использование Cryoinjury

Summary

Данио рерио представляет собой ценную модель для изучения механизмов регенерации сердца у позвоночных. Здесь мы приводим протокол для индукции инфаркта сердца у взрослых данио рерио использование cryoinjury. Этот метод приводит к массовой гибели клеток в пределах 20% от стенок левого желудочка, подобные наблюдаемым в млекопитающих инфарктов.

Abstract

Млекопитающих, сердце не в состоянии значительного восстановления после острой травмы, такие как инфаркт миокарда ^1. В отличие от хвостатых амфибий и костистых рыб сохраняют удивительную способность к регенерации сердца практически без рубцов в течение всей жизни ^2,3. Не известно, почему только некоторые не-млекопитающих, позвоночных можно воссоздать полную орган из остатков ткани ^4,5. Чтобы понять молекулярные и клеточные различия между восстановительной реакции в различных видов, мы должны использовать аналогичные подходы для стимулирования острой травмы.

У млекопитающих, наиболее часто используемые модели для изучения сердечных ремонта была острой ишемии после перевязки коронарной артерии или разрушение ткани после cryoinjury ^6,7. Регенерации сердца у тритонов и рыбок данио были изучены преимущественно после частичной резекции верхушки желудочка ^2,3. В последнее время несколько групп establбедных и обнищавших слоев cryoinjury техники у взрослых ^8-10 рыбок данио. Этот метод имеет большой потенциал, поскольку она позволяет сравнительное обсуждение результатов, полученных от млекопитающих и не млекопитающих.

Здесь мы представляем метод вызывает воспроизводимую форму диска инфаркта данио желудочка cryoinjury. Эта травма модель основана на быстром замораживании-оттаивании тканей, что приводит к массовой гибели клеток около 20% кардиомиоцитов из стенок левого желудочка. Во-первых, небольшой разрез был сделан в грудь с иридэктомия ножницы, чтобы получить доступ к сердцу. Стенок левого желудочка непосредственно заморожены, применяя на 23-25 ​​секунд из нержавеющей стали криозонда предварительном порядке охладить в жидком азоте. Чтобы остановить замораживание сердце, рыба при комнатной температуре была сброшена на кончике криозонда. Процедура хорошо переносится животными, с выживаемостью 95%.

Для характеристики процесса регенерации, сердца былисобрана и установлена ​​на разные дни после cryoinjury. Затем образцы были внедрены для cryosectioning. Слайды с разделами были обработаны для гистологического анализа, гибридизация и иммунофлюоресценции. Это предприятие расширяет наши представления о факторах, которые необходимы для восстановительной пластики в данио рерио, а также обеспечить новому взглянуть на механизмы регенерации сердца. Концептуальные и молекулярной понимания сердца регенерации данио повлияет и биологии развития и регенеративной медицины.

Protocol

1. Подключение оборудования Основным инструментом, используемым для выполнения cryoinjury является криозонда, перо, как инструмент, который сделан из нержавеющей стали (рис. 1а). Цилиндрической ручкой длиной 40 мм и имеет диаметр 8 мм. Кончик аппликатора составляет 6 мм в длину и 0,8 мм в диаметре. Соединения между зондом и ручка конической 4 мм. Кроме того, ручку криозонда должны быть изолированы с пластиковой трубки и ленты, чтобы избежать обморожения на пальцах рук, держа инструмент во время процедуры. Другие материалы, которые необходимы для криохирургии являются стереомикроскоп, острый пинцет, ножницы микро вскрытии весны и пластиковые пипетки передачи. Кроме того, подготовить стакан для анестезии рыбы и пластмассовой ложкой для передачи рыбы. Во время операции, рыбу кладут на влажную губку с вентральной стороной вверх (рис. 1б). Держать животных в устойчивый порядоксоответствующий паз следует вручную вырезать в губку. Подготовить емкость с водой системы передачи рыба после операции. Установка двойной таймер сначала с 10-секундного обратного отсчета, а затем автоматически 24 секундный обратный отсчет. 2. Процедура Cryoinjury Охладить криозонда путем погружения наконечника в 3-5 см жидкого азота в течение 3 мин. Обезболить взрослых данио по immerging его в 0,02% tricaine пока рыба оказывается на спине и ее жабры почти прекратить движение (около 90 секунд). Передача рыба с пластиковой ложкой влажной губкой, разрезанные держать рыбу вниз (рис. 1б). Держите рыбу устойчивый щипцами с использованием не доминантной рукой. Визуально найти заднего медиального края сердца и использовать прямые ножницы иридэктомия, чтобы проколоть кожу. (Рис. 1в). Сделайте небольшой (около 2 мм) разрез над сердце у.е.фитинга прямо вперед через кожу, мышцы (рис. 1D). Не прорваться через костные жаберного аппарата, так как это убить животное. Осторожно оторвать серебристый эпителиального слоя гиподермы (рис. 1Е) кончиком ножниц, чтобы иметь прямой доступ к избиении желудочка. Не вставляйте ножницы глубже в полость тела, так как это прокол сердца. Бьющегося сердца должны быть хорошо видны, и не обширные кровотечения должно происходить во время торакотомии (рис. 1F). Начать запрограммированного таймера, который был установлен на 10 секунд, затем 24 секунд. В течение 10 секунд вынуть криозонда с жидким азотом. Убедитесь, что нет больше азота на криозонда при встряхивании она мягко. Распространение разрез сбоку с помощью щипцов, чтобы открыть сундук (рис. 1F). Когда таймер кольца 10 секунд, нажмите немедленно, но осторожно желудочка с наконечником пр.электронного охлаждения криозонда (рис. 1Г). Когда таймер кольца 24 секунд, налить 2-3 мл воды с помощью системы пластиковых пипетки на грудь, чтобы освободить криозонда из ткани, и передать рыбу в резервуар с системой водоснабжения. Рыбу необходимо перезагрузить дыхание через несколько секунд, а затем он должен возобновить плавание. Если он не дышит, после примерно 45 секунд, стимулируют животных, впрыскивая воду в жабры с пластиковой пипеткой пока он не начнет дышать самостоятельно. По нашему опыту, 95% рыбы пережить операцию, и все случаи смерти приходятся на день операции. Это не будет необходимости сшивать разрезы. 3. Коллекция сердца и фиксации Подготовить 1 мл 2%-ного формалина в микроцентрифуге трубки для фиксации сердца, два пинцета, микро-рассечение ножницами и влажной губкой прорези. В выбранный день после cryoinjury, усыпить рыбу в 0,1% tricaine течение 5 минут. ПоместитеРыба на брюшной стороне в влажных, щелевые губкой. Сделайте большой (около 4 мм) разрез над сердцем через жаберные хряща с микро-рассечение ножницами. Откройте широко разрез с пинцетом (рис. 1 полугодие). Повышение от бульбуса артериальный, белая структура впереди желудочка (рис. 1 HI), и удалить сердце из полости, потянув его. Целый расчлененный сердца показано на рисунке 1J и рис 2А. Разместите до 3 сердца в микроцентрифужных трубки с 1 мл 2%-ного формалина. Осторожно поверните трубку несколько раз, и держать его на ночь при 4 ° C. 4. Сердце Монтаж Промойте сердца в PBS в течение 5 минут. Передача сердца в 10 мл 30% сахарозы, которая должна быть предварительно охладить при температуре 4 ° С, и аккуратно перемешать. Образец должен сначала плавают на поверхности раствора сахарозы. Продолжить инкубации в течение 1 часа 20 минут при 4 ° C. Послена этот раз, сердца будут опускаться на дно трубки. Подготовка коробки с сухим льдом. Возьмем вложение формы и залить 5 мм слой ОКТ монтаж среды на дно формы. С пинцетом поместить сердце в OC T монтаж среды в форме. Под стереомикроскоп, корректировать ориентацию образца для достижения вершины желудочка на дно формы, а бульбуса артериальный к вершине. Поместите формы с образцами на сухом льду. При монтаже средних начинает замерзать, заполнить остальные формы со средним ОКТ и пусть оно замерзает полностью. Держите форму в течение 1 ч при -80 ° C до секционирования. Замороженные образцы могут храниться в течение многих месяцев при температуре -80 ° C. 5. Сердца Секционирование Настройка криостат с режущей размером 16 мкм, температура в камере -24 ° C и температура образца при -22 ° C. Положите замороженный блокобразца в криостате и закрепите его ориентация начала резки параллельно нижней части блока. Подготовит шесть SuperFrost плюс слайды в одном блоке и подсчитывать их от 1 до 6. Начало резки, пока ткань не будет достигнуто, и аккуратный блок по образцу с лезвием. Чтобы получить 6 повторяет одно сердце, возьми первый раздел на слайде 1, второй раздел на слайде 2, третий на слайде 3, и т.д. Как только вы разместили шестой раздел на слайде 6, перезапуск с горкой 1 и продолжается до весь орган вырезать. Соберите два ряда по 8 секций на слайде (рис. 3). Пусть слайды сухой в течение 1 часа при комнатной температуре. Храните их в срок до 1 года в плотно закрытых коробках при температуре -20 ° C. 6. Представитель Результаты Представитель сердечной травмы после этого протокола показан на расчлененное целое сердце в 4 dpci (cryoinjury дней после; Рисунок 2D-F). Для гisualize ткани миокарда в естественных условиях, мы использовали трансгенных рыб выражения EGFP и ядерной DsRed2 под контролем сердечного конкретных cmlc-2 промоутер 11,12. Отсутствие EGFP и DsRed2 флуоресцентные сигналы разграничены дискообразный инфаркт зоны вдоль апикально-боковой стенок левого желудочка. Для выполнения клеточные и молекулярные анализы ткани, сердца были фиксированными и секционные с криостата. Представитель слайд с последовательной серии поперечных разделы сердца показано на рисунке 3. Разделы могут быть проанализированы с различными методами (Рис. 4). Для определения степени регенерации сердца по сравнению с рубцов, мы провели анализ с помощью гистологического кислота фуксин Orange-G (AFOG) окрашивание, которое называет дифференциально сердца и фиброзной ткани 9. Анализ экспрессии генов были достигнуты в соответствии с процедурой в месте гибридизация <suр> 13. Чтобы определить распределение маркеров белков, мы обратились иммунофлюоресценции со специфическими антителами 9. Сочетание различных процедур окрашивания приводит к идентификации молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в сердечной cryoinjury следующие регенерации. Рисунок 1. Вовлечение cryoinjury желудочка у взрослых рыбок данио. (A), фотография криозонда. (B) для взрослых данио помещается в щель губкой с вентральной стороной вверх. (CF) груди разрез для доступа к сердцу. (C) через небольшой разрез кожи и мышц между двумя грудными плавниками (красная линия). (D) ножницы вставляются в разрез резать кожу после красной стрелкой. (E) под кожей, тонким слоем серебристого гиподермы (обведено синим пунктиром) аккуратно открыл доступ к сердцу. (F) разрез распространяется сщипцы и избиение желудочка (зеленая стрелка) доступен для cryoinjury. (G) холодной криозонда аккуратно вставляется в грудь трогать сердца. (ГП) Сердце коллекции. (H), глубокий и длинный разрез через жаберные дуги грудной клетки, чтобы получить доступ к полости перикарда. Две структуры сердца видны: бульбуса артериальный (белая стрелка) и желудочков (зеленая стрелка). (I) бульбуса артериального будет держать пинцетом и вытащил из полости тела. (J) всего сердца вырезали из тела. Рисунок 2. Контроль представителя и cryoinjured сердца расчлененный от взрослых трансгенных данио выражения EGFP и ядерной DsRed2 в кардиомиоциты. (AC) пострадал сердце. (A) темного поля показывает желудочка (V), бульбуса артериальный (Ba, белый) и арматуры (Va), где атриум был связан с желудочка. (В и С) Флуоресцентные изображения т Он нетронутыми EGFP дисплей желудочка и DsRed2 выражение в кардиомиоциты. (DF) сердца в 4 cryoinjury сообщение дней (4 dpci) (D) темного поля показывает, в форме диска миокарда (желтый пунктир). (EF) кардиомиоцитов маркеров EGFP и DsRed2 не обнаруживаются в области инфаркта, с указанием поврежденного миокарда (обведено пунктирной линией). Рисунок 3. Секционирование сердца. (A) от всего сердца с рисунком поперечных разделов, начиная с нижней части сердца (1 и 2 красного цвета) в верхней части сердца (3 и 4 зеленого цвета). (B) Фото слайд-с серией последовательных поперечный срезах, окрашенных AFOG (Acid фуксин Orange-G). Первые разделы (1 и 2 красные квадраты) содержат желудочка вершине, и последний разделы сердце (3 и 4, зеленые квадраты) составляют бульбуса артериальный. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/> Рисунок 4. Примеры анализа, проведенного на сердце разделы на 7 дней после cryoinjury. (A) AFOG (Acid Orange-фуксином G) окрашивание этикетки здоровых клеток в оранжевый, рубцовая ткань содержащие коллаген в синих и фибрина в красный цвет. (B) гибридизация желудочковой тяжелой цепи миозина (vmhc) мРНК визуализирует нетронутыми миокарда (синяя окраска). Поврежденных тканей лишен сердечного расшифровка гена (красная пунктирная линия). (C) Immunoassaying тропомиозина (зеленый) называет нетронутыми кардиомиоцитов и не поврежденные ткани (окруженная пунктирной линией). DAPI (синий) окрашивает ядра всех клеток. (D) генетически меченых кардиомиоцитов экспресс DsRed2 (красный) в их ядрах. DAPI (синий) называет всех ядер. Зона инфаркта не содержит DsRed2-положительных клеток (белая пунктирная линия).

Discussion

Cryoinjury определяется как контролируемое повреждение ткани точное применение холода ^14. Прямой тепловой удар разрушает клетки белком уничтожения и внутриклеточной жидкости, формирование кристаллов льда, который разрывает плазматической мембраны. Следовательно, поврежденные клетки погибают в процессе апоптоза и некроза ^14. Оба эти механизма гибели клеток было показано, что способствует потере тканей после инфаркта миокарда ^15. Таким образом, cryoinjury представляет собой подходящую модель вызывая инфаркт сердца. Ряд исследований об этом хорошо зарекомендовал метод в различных млекопитающих, включая мышей, крыс, кроликов и свиней ^6,7. Адаптация cryoinjury протокол данио позволяет более сравнительного обсуждения инфаркт ответа между различными видами.

Две другие группы независимо друг от друга разработали cryoinjury процедуры для взрослого сердца данио. Основные различия заключаются в поверхностьГери методы, типа инструментов и прикладных время замораживания. В исследовании Гонсалес-Роза и соавт., Перикард открыл разрывая ткани вместо резки. Они использовали 0,3 мм медных нитей связан с трубкой полиамид предварительно охлажденный в жидком азоте, чтобы заморозить сердце на несколько секунд, пока оттаивания можно было наблюдать ^10. В исследовании Шнабель и соавт., Конической части сухого льда длиной 20 мм с заостренным концом 2 мм в диаметре был использован, чтобы коснуться сердца в течение 10 секунд ^8. Обе группы получили желудочка ущерб в результате смерти миокарда. Преимущество нашего метода является более воспроизводимой отложение коллагена богатых шрам, который лучше имитирует раннего инфаркта исцеления ответов наблюдается в млекопитающих.

Важный шаг в cryoinjury процедуру данио делает разрез через кожу и перикард без проколов основной сердце. Правильно performeг операция вызывает небольшое кровотечение. Обильное кровотечение указывает на непреднамеренный прокол левого желудочка с ножницами. В таких случаях животные должны быть втянута в эксперименте. Для того чтобы избежать проколов сердце, точки ножниц должна быть направлена ​​под небольшим углом к ​​коже.

Еще один важный аспект для создания воспроизводимых травмы точное позиционирование холодной криозонда на желудочка для оптимального точный срок. Слишком короткое время замораживания может привести к воспалению с небольшим гибели клеток. Длительные заморозки, с другой стороны, может привести к серьезным повреждениям сердца, что может привести к повышению смертности животных. Мы решили, что оптимальное время для проведения желудочка в замороженном состоянии диапазоне между 23-26 секунд на 2 см в длину взрослые данио рерио, и он может отличаться зависимо от размера животного.

Потому что наш протокол очень просто и быстро, нет никаких экспериментальных пределфлуктуации в подчинении достаточное количество животных для получения адекватной биологической репликации. Криохирургического лечения очень хорошо переносится животными. Коллекция сердца в различные моменты времени после cryoinjury позволяет подробную характеристику на последующих этапах в восстановительный процесс. Экспериментальный анализ cryoinjured сердца может включать: 1) Визуализация транскрипции генов путем гибридизации на месте, 2) определение белка распределения иммунофлуоресцентного окрашивания, 3) гистологические изображения различных структур. Понимание основных процессов заживления после инфаркта миокарда у данио повлияет области регенеративной биологии. Кроме того, он может быть полезным для разработки новых терапевтических подходов в регенеративной медицине.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co., Inc.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8	Polyscience, Inc.	18985