ゼブラフィッシュは、脊椎動物の心臓再生のメカニズムを研究する貴重なモデルを表しています。ここでは、cryoinjuryを用いた成体ゼブラフィッシュの心臓梗塞の誘導のためのプロトコルを提示します。哺乳類の脳梗塞で観察されたものと同様の心室壁の20%以内の大規模な細胞死では、このメソッドの結果、。
哺乳類の心臓は、心筋梗塞1などの急性損傷後の重要な再生が不可能です。対照的に、有尾類、両生類と硬骨魚の魚はほとんど、あるいはまったく生活2,3にわたって瘢痕化した心臓の再生のための驚くべき能力を保持します。唯一のいくつかの非哺乳類の脊椎動物は4,5残留組織からの完全な臓器を再作成することができますなぜそれが知られていません。異なる種の再生応答の間に分子や細胞の違いを理解するために、我々は急性の傷害を誘導するための同様のアプローチを使用する必要があります。
哺乳類では、心臓の修復を研究するために最も頻繁に使用されるモデルは、cryoinjury 6,7後の冠状動脈や組織破壊の結紮後、急性虚血されています。イモリとゼブラフィッシュの心臓再生は、主に心室尖部2,3の一部を切除した後に検討されている。最近、いくつかのグループがestablている大人のゼブラフィッシュの8-10のcryoinjuryテクニックをished。それは、哺乳動物及び非哺乳動物種から得られた結果の比較検討することができますので、このメソッドは、大きな可能性を秘めている。
ここでは、cryoinjuryによるゼブラフィッシュの脳室の再現性の円盤状の梗塞を誘導する手法を提案する。この損傷モデルは、心室壁の心筋細胞の約20%の大規模な細胞死をもたらす急速凍結融解組織に基づいています。まず、小切開は、心臓にアクセスするには虹彩切除術をハサミで胸を介して行われました。心室壁は、直接23から25秒間液体窒素で冷却しステンレス製のクライオプローブを適用することにより、凍結した。心臓の凍結を停止するには、室温での魚の水は、クライオプローブの先端に削除されました。手順については、よく95%の生存率は、動物によって許容されています。
再生過程を特徴づけるために、心があったcryoinjury後、別の日に収集し、修正しました。その後、試料は凍結セクショニングのために埋め込まれていた。セクションを含むスライドがin situハイブリダイゼーションと免疫には 、組織学的分析のために処理した。この事業は、ゼブラフィッシュでの再生可塑性に必要であり、心臓再生の機械に新たな洞察を提供している要因の我々の理解を向上させます。ゼブラフィッシュの心臓再生の概念と分子的理解は、発生生物学と再生医学の両方に影響を与えます。
Cryoinjuryは、極端な寒さ14の正確なアプリケーションによって、組織の制御された損傷と定義されています。直接熱衝撃は、タンパク質の破壊により、プラズマ膜を破裂細胞内液の氷結晶形成により細胞を破壊する。その結果、負傷した細胞はアポトーシスとネクローシス14の過程で死亡しています。これらの細胞死のメカニズムの両方が心筋梗塞15日以降の組織の損失に貢献することが示されている。したがって、cryoinjuryは心臓梗塞を誘発するのに適したモデルを表します。いくつかの研究は、マウス、ラット、ウサギおよびブタ6,7を含む様々な哺乳類でこの井戸を証明する方法を報告した。ゼブラフィッシュにおけるcryoinjuryプロトコルの適応は、異なる種間の梗塞応答について比較検討することができます。
他の2つのグループが独立して大人のゼブラフィッシュの心臓のためにcryoinjury手順を開発しました。大きな違いはシュールです。gery方法、ツールの種類と適用された凍結時間。ゴンサレス·ローザらによる研究では、心膜は、組織を引き裂くの代わりに切断してオープンしました。彼らは、解凍は10観察することができるようになるまで数秒間心臓を凍結し、液体窒素で予冷ポリアミドチューブにリンクされた0.3ミリメートルの銅フィラメントを使用していました。シュナーベルらによる研究では、その直径2 mmの尖った先端を持つ20mmの長さのドライアイスの円錐形のピースが10秒8の心に触れるために使用された。二つのグループは、心筋の死を通して心室の損傷を取得しました。私たちの方法の利点は、優れた哺乳動物系で観察された初期の梗塞治癒応答を模倣したコラーゲンが豊富な傷跡、より再現性の堆積です。
ゼブラフィッシュにおけるcryoinjury手順の間に重要なステップは、基礎となる心臓を穿刺することなく、皮膚と心嚢を通して切開を行っています。正しくperformeD手術は少し出血を引き起こします。多量出血はハサミで心室の意図しない穿刺を示しています。このような場合には、動物実験から退避する必要があります。心臓を穿刺を回避するためには、はさみのポイントは、皮膚に浅い角度を目指すべきである。
再現性の傷害を作成するためのもう一つの重要な側面は、最適な正確な期間の心室に冷たいクライオの正確な位置です。短すぎると凍結時間はほとんど細胞死と炎症になります。長期凍結は、他の一方で、動物の強化された死亡につながる可能性があります心臓の広範な損傷を引き起こす可能性があります。私たちは2センチの大人のゼブラフィッシュのために23から26秒の間凍結状態の範囲内で心室を保持するために最適な時期と判断し、それが動物のサイズに依存して異なる場合があります。
私たちのプロトコルは非常に簡単かつ迅速であるため、実験的な制限はありません適切な生物学的な複製を得るために動物の十分な数を施すことでゴム手袋。凍結手術治療は非常によく動物によって許容されています。 cryoinjury後の異なる時点での心のコレクションは、再生処理中に後続のフェーズの詳細な特性評価を可能にします。 cryoinjured心の実験的解析では、in situハイブリダイゼーションによる遺伝子転写の可視化、2)免疫蛍光染色は、3によるタンパク質分布の検出)は、異なる構造の組織学的イメージング1)を含めることができます。ゼブラフィッシュにおける心筋梗塞後の重要な治癒過程を理解することは、再生生物学の分野に影響を与えます。また、再生医療に新たな治療アプローチを設計するための有益かもしれません。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、優れた技術支援のために、魚のケアのためのV. Zimmermann氏に感謝します。 310000_120611:この作品は、スイス国立科学財団、助成番号によってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |