La inducción de infarto de miocardio en adultos de pez cebra Uso de Cryoinjury

Summary

El pez cebra representa un modelo valioso para estudiar los mecanismos de la regeneración del corazón en los vertebrados. Aquí, se presenta un protocolo para la inducción de un infarto al corazón en adultos de pez cebra con cryoinjury. Este método da como resultado la muerte celular masiva a menos de 20% de la pared ventricular, similar a la observada en los infartos de mamíferos.

Abstract

El corazón de los mamíferos es capaz de una regeneración significativa después de una lesión aguda como el infarto de miocardio ^1. Por el contrario, los anfibios urodelos y peces teleósteos conservan una notable capacidad de regeneración cardíaca con poca o ninguna cicatriz toda la vida ^2,3. No se sabe por qué sólo algunos vertebrados no mamíferos puede volver a crear un órgano completo a partir de tejidos remanentes de ^4,5. Para comprender las diferencias moleculares y celulares entre las respuestas regenerativas en distintas especies, tenemos que utilizar métodos similares para la inducción de lesiones agudas.

En los mamíferos, el modelo más utilizado para estudiar la reparación cardíaca ha sido isquemia aguda después de una ligadura de la arteria coronaria o la destrucción del tejido después de cryoinjury ^6,7. La regeneración cardiaca en los tritones y pez cebra ha sido particularmente estudiados después de una resección parcial de la punta del ventrículo ^2,3. Recientemente, varios grupos han establecISHED la técnica cryoinjury de ^8.10 adultos de pez cebra. Este método tiene un gran potencial debido a que permite un análisis comparativo de los resultados obtenidos de las especies de mamíferos y no mamíferos.

A continuación, presentamos un método para inducir una reproducibles en forma de disco del infarto del ventrículo pez cebra cryoinjury. Este modelo de lesión se basa en una rápida congelación-descongelación del tejido, lo que resulta en la muerte celular masiva de aproximadamente 20% de los cardiomiocitos de la pared ventricular. En primer lugar, de una pequeña incisión se hace a través del pecho con unas tijeras iridectomía para acceder al corazón. La pared del ventrículo se congeló directamente mediante la solicitud de 23-25 ​​segundos, una criosonda de acero inoxidable pre-enfriado en nitrógeno líquido. Para detener la congelación del agua corazón pescado, a temperatura ambiente se dejó caer en la punta de la criosonda. El procedimiento es bien tolerado por los animales, con una tasa de supervivencia de 95%.

Para caracterizar el proceso de regeneración, los corazones estabanrecogido y fijado en diferentes días después de cryoinjury. Posteriormente, la muestra se incluyeron para cryosectioning. Los portaobjetos con las secciones fueron procesadas para el análisis histológico, la hibridación in situ e inmunofluorescencia. Este compromiso mejora nuestra comprensión de los factores que se requieren para la plasticidad de regeneración en el pez cebra, y proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de regeneración cardíaca. Una comprensión conceptual y moleculares de la regeneración cardiaca en el pez cebra tendrá un impacto tanto en la biología del desarrollo y la medicina regenerativa.

Protocol

1. Instalación del equipo La principal herramienta utilizada para llevar a cabo cryoinjury es la criosonda, el instrumento de la pluma-como que está hecha de acero inoxidable (Figura 1A). El mango cilíndrico es de 40 mm de largo y tiene un diámetro de 8 mm. La punta del aplicador es de 6 mm de longitud y 0,8 mm de diámetro. La unión entre la punta y el mango es cónico 4 mm de largo. Además, el mango de la criosonda deben ser aislados con un tubo de plástico y cinta para evitar la congelación de los dedos mientras se mantiene la herramienta durante el procedimiento. Otros materiales que se necesitan para la criocirugía es un microscopio estereoscópico, pinzas cortantes, micro Tijeras de disección de primavera y una pipeta de transferencia de plástico. Además preparar un vaso de precipitados para anestesiar a los peces y una cuchara de plástico para la transferencia de los peces. Durante la cirugía, los peces se colocan en una esponja húmeda con su hasta la parte ventral (fig. 1B). Para mantener el animal en un procedimiento estable, unranura apropiada debe ser cortado manualmente en la esponja. Preparar un tanque con agua del sistema para transferir el pescado después de la cirugía. Establecer un temporizador doble por primera vez con una cuenta atrás de 10 segundos y luego automáticamente una cuenta regresiva de 24 segundos. 2. El Procedimiento Cryoinjury Enfriar la criosonda por inmersión de la punta en 3-5 cm de nitrógeno líquido por lo menos durante 3 min. Anestesie un pez cebra adultos en sumergir en el 0,02% tricaína hasta que el pescado se convierte en su espalda y sus branquias casi deja de moverse (aproximadamente 90 segundos). Transferir el pescado con una cuchara de plástico a una esponja húmeda que ha sido cortado para sostener un pez boca abajo (Figura 1B). Bodega de pescado estable con fórceps mano no dominante. Visualmente localizar el margen posterior medial del corazón y de utilizar tijeras rectas iridectomía para punzar la piel. (Figura 1C). Haga una pequeña (aprox. 2 mm) incisión por encima del corazón por cutting recta anterior a través de la piel, los músculos (Figura 1D). No corte a través del aparato branquial ósea, ya que esto va a matar al animal. Suavemente retire la capa de plata del epitelio de la hipodermis (fig. 1E) con la punta de las tijeras para tener un acceso directo hacia el ventrículo late. No introduzca las tijeras más profunda en la cavidad del cuerpo, ya que esto punción voluntad del corazón. El corazón que late debe estar bien visible, y no hay sangrado abundante debe ocurrir durante la toracotomía (Figura 1F). Inicie el temporizador programado que se ha establecido durante 10 segundos, seguido por 24 segundos. Durante 10 segundos, sacar la criosonda del nitrógeno líquido. Asegúrese de que no hay más nitrógeno en la criosonda agitando suavemente. Extienda la incisión lateralmente con unas pinzas para abrir el pecho (Figura 1F). Una vez que suene el timbre de 10 segundos, tocar de inmediato, pero con cuidado el ventrículo con la punta de la pre-enfriada criosonda (Figura 1G). Una vez que suene el reloj de 24 segundos, vierta 2-3 ml de agua del sistema utilizando una pipeta de plástico en el pecho para liberar la criosonda a partir de tejido, y transferir los peces en el tanque con agua del sistema. El pescado debe reiniciar la respiración después de unos segundos, y entonces debe volver a nadar. Si no respira después de alrededor de 45 segundos, estimular el animal mediante chorros de agua en las branquias con una pipeta de plástico hasta que se comienza a respirar por sí mismo. En nuestra experiencia, 95% de los peces sobrevivir la cirugía, y todas las muertes producen en el día de la cirugía. No será necesario para suturar incisiones. 3. Colección Corazón y fijación Preparar 1 ml de formalina al 2% en un tubo de microcentrífuga para la fijación del corazón, fórceps dos, tijeras de micro-disección y la esponja húmeda ranurada. En el día seleccionado después cryoinjury, la eutanasia a los peces en 0,1% tricaína durante 5 minutos. Coloque elpeces lado ventral hacia arriba en una esponja húmeda, con ranuras. Haga una grande (aprox. 4 mm) incisión por encima del corazón a través del cartílago branquial con las tijeras de disección micro. Abrir ampliamente la incisión con pinzas (Figura 1H). Pellizque el bulbo arterioso, una estructura blanca anterior al ventrículo (Figura 1 HI), y quitar el corazón de la cavidad tirando de él. A todo el corazón disecado se muestra en la Figura 1J y la Figura 2A. Coloque hasta 3 corazones en un tubo de microcentrífuga con 1 ml de formalina al 2%. Gire suavemente el tubo varias veces y mantenerlo durante toda la noche a 4 ° C. 4. Corazón de montaje Lavar los corazones en PBS durante 5 minutos. Transferir los corazones en 10 ml de 30% de sacarosa que debe ser pre-enfriado a 4 ° C, y mezclar suavemente. El espécimen inicialmente debe flotar en la superficie de la solución de sacarosa. Continuar la incubación durante 1 hora y 20 minutos a 4 ° C. Después deeste tiempo, los corazones se hundirá hasta el fondo del tubo. Prepare una caja con hielo seco. Tomar un molde incrustación, y verter una capa de 5 mm de medio de octubre de montaje en la parte inferior del molde. Con pinzas colocar el corazón en la T OC medio de montaje en el molde. Bajo el microscopio estereoscópico, ajustar la orientación de la muestra para conseguir el vértice del ventrículo en la parte inferior del molde, y el bulbo arterioso hacia la parte superior. Coloque los moldes con la muestra en hielo seco. Cuando el medio de montaje empieza a congelar, llenar el resto del molde con el medio de octubre y se deja congelar completamente. Mantener el molde por lo menos durante 1 hora a -80 ° C antes de seccionar. La muestra congelada se puede almacenar durante varios meses a -80 ° C. 5. Corazones de seccionamiento Establecer un criostato con un tamaño de corte de 16 micras, una cámara de temperatura de -24 ° C y la temperatura de la muestra a -22 ° C. Coloque el bloque congelado con elespécimen en el criostato y fijar su orientación para comenzar el corte paralela a la parte inferior del bloque. Preparar seis Superfrost-plus diapositivas por un bloque y numerate ellos de 1 a 6. Empiece a cortar hasta que el tejido se alcanza, y recortar el bloque alrededor de la muestra con una cuchilla de afeitar. Para obtener 6 repeticiones de un mismo corazón, toma la primera sección de la diapositiva 1, la sección segunda de la diapositiva 2, el tercero en la diapositiva 3, etc Una vez que colocó la sexta sección de la diapositiva 6, se reinicia con la diapositiva 1 y continuar hasta el órgano entero se corta. Recoge dos filas de alrededor de 8 secciones de la diapositiva (Figura 3). Que las diapositivas seco durante 1 hora a temperatura ambiente. Guárdelos para un máximo de 1 año en envase perfectamente cerrado a -20 ° C. 6. Los resultados representativos Representante lesión cardiaca después de este protocolo se muestra en la disección de todo corazón a las 4 de DPCI (cryoinjury días después, la figura 2D-F). Para visualize el tejido de miocardio en vivo, hemos utilizado los peces transgénicos que expresan EGFP y DsRed2 nuclear bajo el control de los cardiaca específica CMLC-2 promotor de 11,12. La ausencia de EGFP y DsRed2 señales fluorescentes demarcado una zona de infarto en forma de disco a lo largo de la pared ventricular apical-lateral. Para llevar a cabo los análisis celulares y moleculares de los tejidos, los corazones fueron fijados y se secciona con un criostato. Un representante de diapositivas con una serie consecutiva de secciones transversales del corazón se muestra en la Figura 3. Las secciones pueden ser analizados con métodos diferentes (Figura 4). Para determinar el alcance de la regeneración del corazón en comparación con las cicatrices, se realizó un análisis histológico mediante fucsina ácida naranja-G (AFOG) tinción, que califica diferencialmente los tejidos cardíacos y fibrosis 9. Los análisis de expresión génica se consigue de acuerdo con el procedimiento en la hibridación in situ <sup> 13. Para detectar la distribución de las proteínas marcadoras, se aplicó ensayo de inmunofluorescencia con anticuerpos específicos 9. Una combinación de diversos procedimientos de tinción conduce a la identificación de los mecanismos moleculares y celulares implicados en la regeneración cardiaca después de cryoinjury. Figura 1. Inducir cryoinjury del ventrículo en el pez cebra adulto. (A) Una fotografía de la criosonda. (B) Un pez cebra adulto se coloca en la ranura de la esponja con su lado ventral hacia arriba. (CF) Pecho incisión para acceder al corazón. (C) Una pequeña incisión a través de la piel y los músculos se hace entre las dos aletas pectorales (línea roja). (D) Las tijeras se insertan en la incisión para cortar la piel después de la flecha roja. (E) Debajo de la piel, la fina capa de hipodermis plateada (rodeada por la línea azul discontinua) se abrió con cuidado para tener acceso al corazón. (F) La incisión se extendió con elfórceps y el ventrículo latir (flecha verde) es accesible para cryoinjury. (G) La criosonda frío se introduce suavemente en el pecho para tocar el corazón. (HJ) Corazón colección. (H) realiza una incisión larga y profunda se hace a través de los arcos branquiales del pecho para acceder a la cavidad pericárdica. Dos estructuras del corazón son visibles: bulbo arterioso (flecha blanca) y el ventrículo (flecha verde). (I) El bulbo arterioso se mantenga con una pinza y sacó de la cavidad del cuerpo. (J) El corazón entero se escindió de del cuerpo. Figura 2. Representante de control y los corazones cryoinjured disecados de adultos de pez cebra transgénico que expresa EGFP y DsRed2 nuclear en cardiomiocitos. (CA) ileso corazón. (A) La iluminación de campo oscuro se muestra el ventrículo (V), bulbo arterioso (Ba, blanco) y las válvulas (Va), donde se vinculó la aurícula al ventrículo. (B y C) las imágenes fluorescentes de t que EGFP intacta pantalla ventrículo y DsRed2 expresión en los cardiomiocitos. (DF) Corazón a 4 días después de la cryoinjury (4 DPCI) (D) La iluminación de campo oscuro revela un infarto en forma de disco (línea amarilla discontinua). (EF) cardiomiocitos marcadores EGFP y DsRed2 no se detectan en la zona del infarto, lo que indica el miocardio dañado (rodeado de línea discontinua). Figura 3. La sección del corazón. (A) corazón entero con el dibujo de secciones transversales a partir de la parte inferior del corazón (1 y 2, en rojo) hacia la parte superior del corazón (3 y 4 en verde). (B) Fotografía de una diapositiva con la serie de secciones transversales consecutivas teñidas con AFOG (fucsina ácida naranja-G). Las primeras secciones (1 y 2, plazas rojas) contienen el ápex del ventrículo, y las últimas secciones del corazón (3 y 4, cuadrados verdes) comprenden bulbo arterioso. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/> Ejemplos Figura 4. De análisis realizados en las secciones de corazón a las 7 cryoinjury días después. (A) AFOG (fucsina ácida naranja-G) las etiquetas de tinción de las células musculares sanas en color naranja, el tejido cicatricial que contiene colágeno y fibrina en azul en rojo. (B) La hibridación in situ de la cadena pesada de miosina ventricular (vmhc) ARNm visualiza el miocardio intacto (coloración azul). El tejido dañado está desprovisto de la transcripción de genes cardiacos (línea roja discontinua). (C) Immunoassaying de la tropomiosina (verde) llama a los cardiomiocitos intactas y no en el tejido dañado (rodeado con la línea discontinua). DAPI (azul) tiñe el núcleo de todas las células. (D) cardiomiocitos genéticamente etiquetados expresa DsRed2 (rojo) en sus núcleos. DAPI (azul) llama a todos los núcleos. La zona infartada no contiene DsRed2 de células positivas (línea blanca discontinua).

Discussion

Cryoinjury se define como el daño de tejido controlado por la aplicación precisa de ¹⁴ frío extremo. Choque térmico directo destruye las células por la destrucción de proteínas y por la formación de cristales de hielo intracelular fluido que rompe la membrana plasmática. En consecuencia, las células dañadas mueren en los procesos de apoptosis y necrosis ^14. Estos dos mecanismos de muerte celular se ha demostrado que contribuyen a la pérdida de tejido después de un infarto de miocardio ^15. Así, cryoinjury representa un modelo adecuado de inducir un infarto cardíaco. Varios estudios informaron este método bien probado en diversos mamíferos, incluyendo ratones, ratas, conejos y cerdos ^6,7. La adaptación del protocolo cryoinjury en el pez cebra permite un análisis más comparativo sobre la respuesta del infarto entre las diferentes especies.

Otros dos grupos de forma independiente desarrolló el procedimiento cryoinjury para el corazón del pez cebra adulto. Las principales diferencias son el surmétodos de Gery, el tipo de herramientas y el tiempo de aplicar la congelación. En el estudio de González-Rosa et al., El pericardio fue inaugurada por el desgarro del tejido en lugar de cortar. Ellos usaron 0,3 mm filamento de cobre, vinculada a un tubo de poliamida pre-enfriado en nitrógeno líquido para congelar el corazón durante unos segundos hasta que la descongelación se puede observar ^10. En el estudio de Schnabel et al., Una pieza cónica de hielo seco de 20 mm de longitud con una punta afilada de 2 mm en su diámetro se utilizó para tocar el corazón durante 10 segundos ^8. Los dos grupos obtuvieron el daño ventricular a través de la muerte del miocardio. La ventaja de este método es una deposición más reproducible de rico en colágeno cicatriz, que mejor imita las respuestas infarto primeros curación observadas en los sistemas de mamíferos.

El paso crítico durante el procedimiento cryoinjury en el pez cebra está haciendo una incisión a través de la piel y el saco pericárdico, sin perforar el fondo del corazón. Una correcta Realizamosla cirugía d hace poco de sangrado. Sangrado profuso indica una punción accidental del ventrículo con las tijeras. En tales casos, los animales deben ser retraído a partir del experimento. Con el fin de evitar la perforación del corazón, el punto de tijeras debe estar dirigida a un ángulo superficial de la piel.

Otro aspecto importante para crear una lesión reproducible es el posicionamiento exacto de la criosonda frío en el ventrículo para la duración precisa óptima. El tiempo de congelación es demasiado corto tendrá como resultado la inflamación con la muerte celular poco. Congelación prolongada, por otro lado, puede causar daño extenso del corazón, lo que puede conducir a la mortalidad mejorada de los animales. Se determinó que el tiempo óptimo para mantener el ventrículo en los rangos de estado congelado entre 23-26 segundos para un adulto 2 cm pez cebra largo, y puede variar en dependencia de la tamaño de los animales.

Debido a que nuestro protocolo es muy simple y rápido, no hay límite experimentalciones en someter a un número suficiente de animales para obtener suficientes repeticiones biológicos. El tratamiento de criocirugía es muy bien tolerado por los animales. Colección de los corazones en diferentes puntos temporales después de cryoinjury permite la caracterización detallada de las fases posteriores durante el proceso de regeneración. El análisis experimental de los corazones cryoinjured puede incluir: 1) la visualización de la transcripción de genes por hibridación in situ, 2) la detección de la distribución de las proteínas mediante la tinción de inmunofluorescencia, 3) la imagen histológica de las diferentes estructuras. La comprensión de los procesos de curación después de un infarto de miocardio clave en el pez cebra impactará en el campo de la biología regenerativa. Por otra parte, podría ser beneficioso para el diseño de nuevos enfoques terapéuticos en la medicina regenerativa.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instrument Co., Inc.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8	Polyscience, Inc.	18985