דג הזברה מהווה מודל חשוב ללמוד את מנגנוני התחדשות לב אצל בעלי חוליות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אינדוקציה של אוטם לב דג הזברה למבוגרים באמצעות cryoinjury. שיטה זו גורמת מוות של תאים מסיבית של 20% קיר החדר, בדומה לזו שנצפתה אוטמים יונקים.
לב היונקים אינו מסוגל התחדשות משמעותית בעקבות פציעה אקוטית כגון אוטם שריר הלב 1. לעומת זאת, urodele דו חיים ודגים teleost לשמור על היכולת המדהימה של התחדשות לב עם מעט או ללא צלקות לאורך כל החיים 2,3. לא ידוע מדוע רק כמה חוליות שאינם יונקים יכולים לשחזר את איבר שלם מרקמות שריד 4.5. כדי להבין את ההבדלים מולקולרית תאית בין התגובות רגנרציה במינים שונים, אנחנו צריכים להשתמש גישות דומות עבור גרימת פציעות חריפה.
אצל יונקים, המודל השכיח ביותר ללמוד תיקון הלב כבר איסכמיה חריפה לאחר קשירת העורק הכלילי או הרס רקמות לאחר cryoinjury 6,7. התחדשות לב ב הסלמנדרות ו דג הזברה נחקרה בעיקר לאחר כריתה חלקית של החדר איפקס 2,3. לאחרונה, מספר קבוצות יש established טכניקה cryoinjury ב 8-10 דג הזברה בוגרים. לשיטה זו פוטנציאל גדול, כי זה מאפשר דיון השוואתי של תוצאות שהתקבלו מיני יונקים ולא יונקים.
כאן, אנו מציגים שיטה לגרום האוטם לשחזור בצורת דיסק של החדר על ידי דג הזברה cryoinjury. מודל זה מבוסס על פגיעה ברקמות הקפאה, הפשרה מהירה, שתוצאתה מוות של תאים מסיבית של 20% cardiomyocytes של קיר החדר. ראשית, חתך קטן נעשה דרך החזה עם מספריים iridectomy לגשת לב. קיר החדר היה קפוא ישירות על ידי יישום של 23-25 שניות cryoprobe נירוסטה precooled בחנקן נוזלי. כדי להפסיק את הקפאת המים, הלב דגים בטמפרטורת החדר הושלכה על קצה cryoprobe. הליך זה נסבל היטב על ידי בעלי חיים, עם שיעור הישרדות של 95%.
כדי לאפיין את תהליך ההתחדשות, לבבות היואסף קבועה בימים שונים לאחר cryoinjury. לאחר מכן הדגימה היו מוטבעים על cryosectioning. שקופיות עם חלקים עובדו לניתוח היסטולוגית, על ההכלאה immunofluorescence באתרו. התחייבות זו משפר את הבנתנו את הגורמים הנדרשים הפלסטיות רגנרטיבית של דג הזברה, ולספק תובנות חדשות על מכונות של התחדשות הלב. הבנה רעיונית המולקולרי של התחדשות לב דג הזברה תשפיע גם בביולוגיה התפתחותית ורפואה רגנרטיבית.
Cryoinjury מוגדר נזק מבוקר של רקמה על ידי יישום מדויק של 14 קור קיצוניים. הלם תרמי ישירה הורסת את התאים על ידי הרס החלבון ועל ידי קרח תאיים היווצרות גבישים נוזלים כי נקרע קרום הפלזמה. כתוצאה מכך, התאים הפצועים למות תהליכי אפופטוזיס ונמק 14. שני אלה מנגנוני מוות של תאים הוכחו לתרום אובדן רקמות לאחר אוטם שריר הלב 15. לכן, cryoinjury מייצג מודל מתאים של גרימת אוטם שריר הלב. מספר מחקרים דיווחו על שיטה זו הוכיחה גם אצל יונקים שונים, כולל עכברים, חולדות, ארנבות וחזירים 6,7. עיבוד של פרוטוקול cryoinjury של דג הזברה מאפשר דיון השוואתי נוסף על התגובה האוטם בין מינים שונים.
שתי קבוצות אחרות פיתחו באופן עצמאי את ההליך cryoinjury ללב דג הזברה מבוגר. ההבדלים העיקריים הם סורגרי שיטות, סוג של כלי וזמן הקפאה שימושית. במחקר ידי רוזה גונזלס, et al., קרום הלב נפתח על ידי קריעת רקמות במקום חיתוך. הם השתמשו נחושת 0.3 מ"מ חוט קשור צינור פוליאמיד מראש מקורר בחנקן נוזלי להקפיא את הלב של שניות עד הפשרת יכול להיבחן 10. במחקר של שנאבל et al., פיסת חרוטי קרח יבש באורך 20 מ"מ עם קצה מחודד של 2 מ"מ בקוטר שלה שימש לגעת בלב למשך 10 שניות 8. שתי הקבוצות השיגו נזק חדרית דרך מותו של שריר הלב. היתרון של השיטה שלנו היא בתצהיר לשחזור יותר צלקת קולגן עשיר, אשר מחקה יותר טוב את הריפוי המוקדמות האוטם התגובות שנצפו מערכות יונקים.
צעד קריטי במהלך ההליך cryoinjury על דג הזברה הוא עושה חתך דרך העור ואת שק קרום הלב, ללא ניקוב הלב הבסיסית. Performe נכוןניתוח ד גורמת לדימום קטן. דימום פזרני מציין לנקב לא מכוונת של החדר עם המספריים. במקרים כאלה, בעלי החיים יש חזר בו מן הניסוי. כדי למנוע ניקוב הלב, הצבע מספריים צריך להיות מכוון בזווית שטוחה על העור.
היבט חשוב נוסף ליצירת פגיעה לשחזור הוא המיקום המדויק של cryoprobe קרים על החדר למשך מדויקת אופטימלית. זמן הקפאה קצר מדי תגרום לדלקת עם מוות של תאים קטן. הקפאה ממושכת, לעומת זאת, עלול לגרום נזק רב של הלב, דבר שעלול להוביל לתמותה מוגברת של בעלי החיים. קבענו כי הזמן האופטימלי להחזיק את החדר בטווחים המדינה קפואים בין 23-26 שניות על דג הזברה 2 ס"מ מבוגר, והוא עשוי להיות שונה dependently על גודל של בעלי החיים.
כי בפרוטוקול שלנו היא מאוד פשוטה ומהירה, אין גבול הניסיוניations ב העמדת מספר מספיק של בעלי חיים להשיג משוכפלים ביולוגיים מתאימים. טיפול cryosurgical נסבל היטב על ידי בעלי החיים. אוסף של לבבות בנקודות זמן שונות לאחר cryoinjury מאפשר אפיון מפורט של השלבים הבאים בתהליך ההתחדשות. ניתוח ניסיוני של לבבות cryoinjured עשויים לכלול 1) ויזואליזציה של שעתוק הגנים על ידי הכלאה ב באתרו, 2) זיהוי של חלבון על ידי חלוקת מכתים immunofluorescent, 3) הדמיה היסטולוגית של מבנים שונים. הבנת תהליכי ריפוי מפתח לאחר אוטם שריר הלב על דג הזברה ישפיע על תחום הביולוגיה רגנרטיבית. יתר על כן, זה יכול להיות מועיל עבור תכנון גישות טיפוליות חדשניות ברפואה רגנרטיבית.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים ו 'צימרמן לקבלת סיוע טכני מעולה לטיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע, מענק מספר: 310000_120611.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |