Zebrafish representa um modelo útil para estudar os mecanismos de regeneração do coração nos vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para a indução de um infarto do coração em adultos usando cryoinjury zebrafish. Este método resulta em morte celular maciça dentro de 20% da parede ventricular, semelhantes às observadas em infartos de mamíferos.
O coração de mamífero é incapaz de regeneração significativa na sequência de uma lesão aguda, tais como enfarte do miocárdio 1. Em contraste, urodele anfíbios e peixes teleósteos reter uma notável capacidade para a regeneração cardíaca com pouca ou nenhuma cicatriz ao longo da vida 2,3. Não se sabe porque apenas alguns vertebrados não-mamíferos pode recriar um órgão completo a partir de tecidos remanescentes 4,5. Para entender as diferenças moleculares e celulares entre as respostas regenerativas em espécies diferentes, é preciso usar abordagens semelhantes para induzir lesões agudas.
Nos mamíferos, o modelo mais utilizado para estudar reparação cardíaca tem sido isquemia aguda após a ligadura da artéria coronária ou destruição do tecido após cryoinjury 6,7. A regeneração cardíaca em salamandras e peixes-zebra tem sido predominantemente estudada após uma ressecção parcial do ventrículo ápice 2,3. Recentemente, vários grupos têm establtada a técnica cryoinjury em 8-10 peixe-zebra adultos. Este método tem um grande potencial porque permite uma discussão comparativo dos resultados obtidos a partir das espécies de mamíferos e não mamíferos.
Aqui, nós apresentamos um método para induzir um enfarte em forma de disco reprodutível do ventrículo peixe-zebra por cryoinjury. Este modelo de lesão é baseada sobre o tecido de congelamento-descongelamento rápido, o que resulta na morte da célula maciça de cerca de 20% de cardiomiócitos da parede ventricular. Primeiro, uma pequena incisão foi feita através do peito com uma tesoura iridectomia para acessar o coração. A parede ventricular foi congelado diretamente através da aplicação de 23-25 segundos, uma criossonda aço inoxidável pré-arrefecido em azoto líquido. Para parar o congelamento da água de peixe coração, à temperatura ambiente foi lançada sobre a ponta do criossonda. O procedimento é bem tolerado pelos animais, com uma taxa de sobrevivência de 95%.
Para caracterizar o processo regenerativo, os corações foramcoletados e fixados em diferentes dias após cryoinjury. Posteriormente, a amostra foram incorporadas para cryosectioning. As lâminas com secções foram processadas para análise histológica, hibridação de situ e imunofluorescência. Esta empresa aumenta a nossa compreensão dos fatores que são necessários para a plasticidade regenerativa no peixe-zebra, e fornecer novos insights sobre os mecanismos de regeneração cardíaca. Um entendimento conceitual e molecular da regeneração cardíaca em zebrafish afetará tanto a biologia do desenvolvimento e da medicina regenerativa.
Cryoinjury é definido como o dano de tecido controlada pela aplicação precisa de 14 frio extremo. Choque térmico directo destrói as células por destruição de proteínas e por intracelular formação de cristais de gelo de fluido que rompe a membrana plasmática. Por conseguinte, as células lesadas morrer nos processos de apoptose e necrose 14. Ambos estes mecanismos de morte celular têm sido mostrados para contribuir para a perda de tecido após enfarte do miocárdio 15. Assim, cryoinjury representa um modelo adequado de induzir um enfarte cardíaco. Vários estudos têm relatado este método bem provado em vários mamíferos, incluindo camundongos, ratos, coelhos e suínos 6,7. A adaptação do protocolo cryoinjury em peixes-zebra permite uma discussão mais comparativa sobre a resposta do enfarte entre diferentes espécies.
Dois outros grupos independentemente desenvolveu o procedimento cryoinjury para o coração do peixe-zebra adulto. As principais diferenças são o surmétodos Gery, o tipo de ferramentas e aplicado tempo de congelamento. No estudo de González et al-Rosa., O pericárdio foi aberto rasgando o tecido em vez de cortar. Usaram 0,3 filamento de cobre milímetros ligada a um tubo de poliamida pré-arrefecidos em azoto líquido para congelar o coração durante alguns segundos até descongelamento pode ser observado 10. No estudo de Schnabel et ai., Um pedaço de gelo seco cónico de 20 mm de comprimento com uma extremidade pontiaguda de 2 mm no seu diâmetro foi usado para tocar o coração durante 10 segundos 8. Os dois grupos obtiveram dano ventricular através da morte do miocárdio. A vantagem do nosso método é uma deposição mais reprodutível de colagénio-rico cicatriz, o que melhor imita as respostas precoces infarto de cura observados em sistemas de mamíferos.
O passo crítico durante o procedimento de cryoinjury em peixes-zebra está a fazer uma incisão através da pele e do saco pericárdico sem puncionar o coração subjacente. Uma corretamente performed cirurgia provoca pouco sangramento. Sangramento profuso indica uma punção não-intencional do ventrículo com a tesoura. Em tais casos, os animais devem ser retraído a partir da experiência. A fim de evitar a perfuração do coração, do ponto de tesoura deve ser dirigida a um ângulo raso para a pele.
Outro aspecto importante para a criação de uma lesão reprodutível é o posicionamento exacto da cryoprobe frio no ventrículo para a duração óptima preciso. Demasiado curto tempo de congelamento vai resultar em inflamação com a morte de células pouco. O congelamento prolongado, por outro lado, pode causar danos extensos do coração, o que pode levar à mortalidade melhorada dos animais. Nós determinamos que o tempo óptimo para segurar o ventrículo nas gamas estado congelado entre 23-26 segundos para um 2 centímetros peixe-zebra longo do adulto, que pode ser diferente dependente do tamanho dos animais.
Porque o nosso protocolo é muito simples e rápida, não há nenhum limite experimentalções em sujeitando número suficiente de animais para obter adequados repetições biológicas. O tratamento criocirúrgico é muito bem tolerada pelos animais. Colecção dos corações em momentos diferentes após cryoinjury permite a caracterização detalhada das fases subseqüentes durante o processo regenerativo. A análise experimental dos corações cryoinjured pode incluir 1) visualização da transcrição de genes por hibridização in situ, 2) detecção de distribuição de proteína por coloração imunofluorescente, 3) imagiologia histológica de estruturas diferentes. Compreender os processos de cura chave após infarto do miocárdio em zebrafish terá impacto no campo da biologia regenerativa. Além disso, pode ser benéfico para a concepção de novas abordagens terapêuticas em medicina regenerativa.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a V. Zimmermann para a assistência técnica excelente e de cuidado dos peixes. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation suíço, número de concessão: 310000_120611.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |