Summary
Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die Verwendung
Abstract
Mittelhirn Dopamin (MDDA) Neuronen Projekt über die mediale Vorderhirnbündel gegen mehrere Bereiche im Telencephalon, einschließlich des Striatum ein. Umgekehrt innervieren Medium stachelige Neuronen im Striatum, die Anlass zur striatonigralen (direkten) Weg geben, die Substantia nigra 2. Die Entwicklung dieser Axonen des ZNS ist abhängig von den Aktionen der kombinatorischen einer Fülle von Axon Wachstum und Führung Cues einschließlich Moleküle, die von Neuriten oder durch (Zwischen-) Ziel-Regionen 3,4 freigesetzt werden. Diese löslichen Faktoren können in vitro durch Kultivieren MDDA und / oder striatalen Explantate in einem Kollagenmatrix, die eine dreidimensionale Substrat für die Axone Nachahmen der extrazellulären Umgebung bietet untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kollagenmatrix für die Bildung von relativ stabilen Gradienten von Proteinen durch andere Explantate oder Zellen in der Umgebung (z. B. siehe Referenzen 5 und 6) angeordnet ist freigegeben. Hier beschreiben wir Verfahren für die PURifizierung von Rattenschwanzkollagen, Mikrodissektion von dopaminergen und striatalen Explantate, ihre Kultur in Kollagen-Gelen und anschließender immunhistochemische und quantitative Analyse. Erstens sind die Gehirne von E14.5 Maus Embryonen isoliert und dopaminerge und striatalen Explantate mikrodissezierten. Diese Explantate werden dann (Co) in Kollagengelen auf Deckgläsern gezüchtet für 48 bis 72 Stunden in vitro. Anschließend sind axonale Projektionen visualisiert mit neuronalen Marker (zB Tyrosin-Hydroxylase, DARPP32 oder βIII Tubulin) und Axon-Wachstum und anziehend oder abstoßend Axon Antworten werden quantifiziert. Diese neuronale Zubereitung ist ein nützliches Werkzeug für die in vitro-Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen von mesostriatal und striatonigralen Axonwachstum und Beratung bei der Entwicklung. Mit diesem Test ist es auch möglich, andere (Zwischen-) Ziele für die striatalen dopaminergen und Axonen zu beurteilen oder zu spezifischen molekularen Signale zu testen.
Protocol
1. Vorbereitung der Rattenschwanzkollagen
- Sammle 10.06 erwachsenen Rattenschwänzen (ist es möglich, die Schwänze bei -20 ° C bis zur Verwendung zu speichern).
- Weichen Sie die Schwänze in 95% Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur (RT).
Dissektion der Rattenschwänzen (in Gewebekulturen Haube):
(Halten Sie Ihre Werkzeuge in 70% Ethanol, wenn nicht mit ihnen und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen, Tools und Glaswaren im Rahmen dieses Verfahrens benutzt steril sind)
- Um Sehnen aus den Schwänzen zu sammeln, schneiden Sie die Spitze des Schwanzes. Halten Sie große Ende des Schwanzes mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine andere Zange in der Hand, biegen und brechen den Schwanz in der Nähe der anderen Pinzette. Auseinander ziehen und die Sehnen werden zurückgelassen (Abbildung 1A, B).
- Sammeln Sie die Sehnen in sterilem H 2 O und nach Einholung aller Sehnen verschieben Sie sie auf eine neue Petrischale mit sterilem H 2 O
- Nehmen Sie 2-3 Sehnen und zerkleinern diese mit 2 Paar fürSteinpilze in einem neuen Petrischale mit sterilem H 2 O Entfernen Sie nicht Sehnengewebe wie Venen (Sehnengewebe ist glänzend und reflektierend; 1C). Nach dem Entfernen aller nicht-Sehnengewebe ergibt jede Schwanz etwa 100-150 mg von Sehnen.
- Übertragen Sie die Sehnen zu 300 ml steriler 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C.
- Fügen Sie eine weitere 200 ml sterile 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C.
- Zentrifugieren der Essigsäurelösung, enthaltend die Sehnen bei ~ 2700 × g für 120 min bei 4 ° C bis Pellet nicht gelösten Sehnen und nicht Sehnengewebe.
- Während der Zentrifugation vorbereiten Dialyseschlauch:
- schneiden Stücke von 40 cm
- kochen in 500 uM EDTA für 5 min
- cool in sterilem H 2 O
- Verknoten an einem Ende der Dialyseschläuche und füllen den Schlauch mit dem Überstand des zentrifugierten Sehne Lösung auf Eis in der Gewebekulturabzug unter Verwendung eines automatischen abpipettierene und eine 25 ml Pipette. Vermeiden Sie Blasen entstehen. Knoten das andere Ende des Schlauchs und zu speichern Schlauch auf sterile Aluminiumfolie auf Eis, bis alle Schlauchstücke gefüllt (1D).
- Planen 10 l sterile 0,1 × MEM, pH 4,0, in der Gewebekultur Haube. Fügen Sie Floater in Stücke von Schläuchen und fügen Sie diese dem vorgekühlten 0,1 × MEM-Lösung in einem 10-l-Becherglas. Dialysieren über Nacht bei 4 ° C unter langsamem Rühren. Diese Dialyse entfernt überschüssige Säure unter Beibehaltung der pH-Wert niedrig.
- Durch neue vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren über Nacht bei 4 ° C.
- Wiederholen Sie diesen Schritt durch den Austausch mit neuen vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren, über Nacht bei 4 ° C.
- Aliquotieren Kollagenlösung in sterile 50 ml Röhrchen. Shop-Aliquots bei 4 ° C Halten Sie 6-12 Monate, nur dann transportieren die Kollagen-Lager in der Gewebekultur Kapuze.
- Es ist wichtig, zu testen, ob das gereinigte Kollagen verdünnt (in 0,1 × MEM) werden muss, um optimale Ergebnisse in dem Collagen zu erhalten matrix-Assay. Daher erzeugen eine Kollagen Verdünnungsreihe (unverdünnt Kollagen, 1:1, 1:2 und 1:5 verdünnt) und führen Kollagenmatrix-Assays, wie unten für die optimale Kollagen Verdünnung zu bestimmen beschrieben.
2. Dissektion des dopaminergen Mittelhirns 7,8
- Sezieren E14.5 Maus-Embryonen aus der Gebärmutter der Mutter und halten in L15 Medium auf Eis, bis sie benötigt.
Alle nachfolgenden Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt.
- Herauspräparieren das Gehirn.
- Entfernen Sie das Telencephalon durch Schneiden entlang der medialen Teil jedes telencephalen Vesikel (verwenden Sie die telencephalen Vesikel für striatalen Explantate).
- Entfernen Sie die meningealen Scheide.
- Machen Sie einen dorsoventralen Schnitt nur rostral des mesencephalen Flexur.
- Machen Sie einen anderen dorsoventralen Schnitt unmittelbar kaudal des mesencephalen Flexur.
- Machen Sie einen rostrokaudalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einem microdissection Messer, um die zugrunde liegenden ventralen Mittelhirn Gewebe freizulegen. Achten Sie darauf, den ventralen Mittelhirn Gewebe betroffen, da sie die dopaminergen Neuronen (Abbildung 2) enthält.
- Machen Sie zwei seitliche Schnitte rostrokaudalen und parallel zur ventralen Mittellinie zu dorsalen Mittelhirn Gewebe zu entfernen.
- Teilen Sie die verbleibenden ventralen Mittelhirn Gewebe in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion.
- Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung.
3. Präparation des Striatum
Alle Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt.
- Verwenden Sie telencephalen Vesikel während Mittelhirn Dissektion seziert.
- Entfernen Sie den Thalamus, indem zwischen dem Thalamus und Striatum mit einer Pinzette.
- Machen Sie ein mediolateral Schnitt rostral des Striatum zu rostralen Strukturen wie der Riechkolben zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt für Gewebe kaudal des Striatum gelegen.
- Positiondie restlichen Scheiben, eine koronare Ansicht des Striatum zu erhalten (Abbildung 2).
- Das Striatum kann als etwas weniger dicht (transparenter) Teil des Gewebes erkannt werden. Präparieren Sie das Striatum und Schnitt in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion. Vermeiden Sie den etwas dunkleren Gewebe in der Nähe der Mittellinie, die Migration von Neuronen des lateralen und medialen Ganglion Eminenz enthält.
- Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung.
4. Montage Kollagen-Matrix-Assays
Vorbereitung des Kollagens (alle Schritte auf Eis gekühlt verwenden Pipettenspitzen)
- Mischen Sie 860 ul verdünnte Kollagen mit 100 ul 10x MEM und 40 ul 1 M Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) und halten Sie auf dem Eis. Wenn an dieser Stelle das Kollagen wärmt es wird sich verfestigen.
- Einen Tropfen von 20 ul (ca. 5 mm Durchmesser) von vorbereiteten Kollagen zu einem Deckglas in eine Vertiefung einer 4-Well Nunc Gerichtund lassen Sie es in einem CO 2-Inkubator stehen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min (Umgebungstemperatur O 2-Konzentration ist ausreichend). Während der Inkubation wird das Kollagen gelatinieren.
Setup-Co-Kultur in Kollagen-Gel
- Nachdem das Kollagen geliert ist, verwenden Sie eine Pipette mit 200 pl Spitze, eine dopaminerge oder striatalen Explantat an das Kollagen zu übertragen.
- Bewegen der Explantate in enger Nähe zueinander unter Verwendung einer Nadel. Halte sie in einem Abstand von etwa dem Durchmesser einer Explantat (~ 200-300 um) (Abb. 2).
- Entfernen Sie überschüssiges Medium und fügen 20 ul vorbereiteten Kollagen auf der Oberseite der Explantate. Dadurch entsteht häufig die Explantate zu bewegen. Positionieren Sie die Explantate mit einer Nadel wie in 4.4 beschrieben.
- Lassen Sie die Kollagen verfestigen für 15 min bei RT gefolgt von 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
- Nachdem das Kollagen gesetzt hat, fügen Sie 400 ul explant Medium wachsen und für 2-3 Tage in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2.
5. Die Analyse durch Immunhistochemie und Quantifizierung
Immunhistochemie
- Um Explantate zu beheben, fügen Sie sanft 400 ul von 8% Paraformaldehyd (PFA) in PBS auf 400 ul Medium (und damit Verdünnung des PFA bis 4%) und lassen Sie stehen für 1 Stunde bei RT.
- Waschen 3x 15 min in PBS bei RT.
- Inkubieren in Blocking-Puffer (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) für 2 Stunden.
- Über Nacht inkubieren mit Primärantikörper in BB bei 4 ° C Für dopaminergen Axonen verwenden Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper (1:1000) 7, für striatalen Axone Anti-DARPP32 Antikörper (1:500) 9 und für die Visualisierung aller Axone Anti-βIII Tubulin (1:3000) 7.
- Waschen 5x 1 Stunde in PBS bei RT.
- Inkubation mit sekundären Antikörpers, der an den entsprechenden Fluorophors (1:500) in BB über Nacht bei 4° C Von diesem Schritt auf Minimierung der Exposition der Explantate auf Licht (zB bedecken Sie sie mit Alufolie).
- Waschen in PBS über Nacht bei 4 ° C, gefolgt von mehreren Wäschen während des nächsten Tages.
- Montieren Sie Explantate auf Objektträgern mit Prolong Antifade Reagenz Eindeckmedium. Einen Tropfen ~ 10 ul auf einem Objektträger. Nehmen Sie das Deckglas und legen Sie sie vorsichtig auf den Tropfen Eindeckmedium mit dem Explantat Seite nach unten. Vermeiden Sie Trapping keine Luft unter de Deckglas durch sehr schonend senken sie auf den Tropfen Eindeckmedium.
Die Quantifizierung durch die Berechnung P / D-Verhältnis
- Erwerben Sie digitale Bilder der Explantate mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 3).
- Unter Verwendung dieser Bilder, teilen jedes Explantat in Quadranten, um ein proximales Quadranten (dh ein Teil des Explantats am nächsten zu dem benachbarten Explantat) und ein distales Quadranten (Teil der Explantat von der benachbarten Erläuterungen zu erzeugen weitestennt) (2, 4).
- Die Länge von 20 längsten Neuriten, die aus dem Explantat sowohl in den proximalen und distalen Quadranten.
- Verwendung der durchschnittlichen Länge der 20 längsten Neuriten, die P / D-Verhältnis für jeden einzelnen Explantat berechnen. AP / D-Verhältnis> 1 bedeutet, Axon Attraktion, während ein Verhältnis <1 bedeutet, Axon Abstoßung.
- In einigen Fällen verhindert die dichte Wachstum von Neuriten die Bewertung der einzelnen Neuritenlänge. In diesen Situationen kann die Quantifizierung durch Messen des Abstands zwischen dem Rand des Explantats und dem vorderen vor Axonwachstum in den proximalen und distalen Quadranten werden.
6. Repräsentative Bilder
Nach der erfolgreichen Kultur der striatalen dopaminergen und Explantate eine große Anzahl von Axonen sind sichtbar mit Hellfeld-Mikroskopie oder wie visualisiert durch anti-Tubulin βIII Immunzytochemie (nicht dargestellt). Ein Teil dieser Axone dopaminergen oder s. triatal Axone als visualisiert mittels Immunzytochemie (Abbildung 3). Durch die Aufteilung der Explantate in Quadranten wie beschrieben und die Bestimmung P / D-Verhältnissen, kann eine putative Axon anziehende oder abstoßende Wirkung quantifiziert (Abbildung 3E) werden.
Abbildung 1. Fotos zur Darstellung der Herstellung von Kollagen aus Rattenschwanzsehnen. A) Auseinanderziehen der Rattenschwanz macht die Sehnen. B) Sehnen sind sichtbar als seil-Bundles. C) Die Sehnen sind problemlos von Venen durch ihre glänzend weißes Aussehen unterscheiden. D) Nach Auflösen der Spannglieder in Essigsäure, wird die Lösung in einen Dialyseschlauch übertragen. Um die gelösten Kollagen kalt zu halten, werden die Rohre auf sterile Aluminiumfolie auf Eis gestellt.
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2. Schema, das die verschiedenen Schritte des Verfahrens. Entsprechende Hirnregionen werden seziert und geschnitten, um Explantate zu generieren. Eine einzelne Mittelhirn und Striatum Explantat in unmittelbarer Nähe in einer Kollagenmatrix angeordnet und dann für 48-72 Stunden bei 37 ° C wachsen Axone werden visualisiert durch Fluoreszenz Immunhistochemie und ein P / D-Verhältnis wird berechnet, um chemotropische Antworten zu quantifizieren.
3. Repräsentative Ergebnisse zeigen Axonwachstum in einer Kollagenmatrix Kultur. A) Mittelhirn Explantat mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase Antikörper enthüllt Axon Auswuchs gefärbt. Gepunktete Linie zeigt neben Explantat. B) Vergrößerung eines einzelnen Neuriten zeigen und das Wachstum Kegel (Pfeile). C) Striatale Explantat mit Anti-DARPP32 gefärbt. D) Vergrößerung der einzelnen Neuriten C zeigt. E) BeispielP / D-Verhältnis Quantifizierung. Explantate werden in gleiche Sektoren eingeteilt. Das proximale Quadrant wird mit Blick auf den angrenzenden Explantat während das distale Quadranten weg von ihm zugewandt ist. Scale-Balken zeigen 100 um.
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Discussion
Die Kollagenmatrix hier beschriebenen Assay verwendet wurde und von vielen verschiedenen Labors in den letzten Jahrzehnten verbessert, um eine Vielzahl von Axonen Molekülen und neuronalen Systemen untersuchen (zB siehe Referenzen 5-8). Diese Studien haben gezeigt, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Wirkungen und Regulation der axonale Wegfindung Moleküle, die durch verschiedene (Zwischen-) Ziel-Geweben sezerniert wird.
Es sollte jedoch angemerkt, dass die Kollagenmatrix ein Ersatz für die extrazelluläre Umgebung (ECM) ist aber klar fehlt vielen Proteinen, die normalerweise in der ECM werden. Komponenten der ECM sind dafür bekannt, die Auswirkungen von Axonen 10 Moleküle beeinflussen. Dennoch ist die Kollagenmatrix Assay besonders zur Untersuchung grundlegenden molekularen Mechanismen in vitro und in Kombination mit anderen Gewebekultur Ansätze (z. B. organotypischen Kulturen 11) oder die Analyse von genetisch veränderten Tiermodellen. Mehrere Faktoren bestimmen den Erfolg der Kollagen-Matrix-Assay. Erstens ist die Größe der Explantate entscheidend für optimale Axonwachstum. Große striatalen dopaminergen und Explantaten zeigen oft begrenzten Axonwachstum, während kleine und unregelmäßige Explantate fasciculated Auswuchs zeigen. Ferner ist der Abstand zwischen den einzelnen Explantate einen großen Einfluss auf die Wirkung ein sezerniertes Molekül an benachbarten Explantate ausüben kann. Wenn die Explantate zu weit voneinander entfernt sind, werden frei bewegliche Moleküle nicht den Explantaten zu erreichen. Umgekehrt, wenn der Abstand zu klein ist, kann Axone in die angrenzenden Explantate wachsen, macht es schwierig, qualitativ und quantitativ beurteilen Axonwachstum und Führung. Schließlich ist die Qualität des Rattenschwanzkollagen wichtig und wird direkt mit dem Auswachsen von Axonen und das Überleben von Explantaten korreliert.
Der hier beschriebene Assay kann auf verschiedene Weise auf spezifische Fragestellungen anzugehen geändert werden. Zum Beispiel, Zugabe vonFunktion blockierende Antikörper gegen das Wachstumsmedium ermöglicht die funktionelle Hemmung des (Kandidaten-) Moleküle. Darüber hinaus können Explantate mit Zellaggregate sezernierenden spezifischen Axonwachstum und Führung Faktoren kombiniert werden. Schließlich könnte Explantate von GFP-Reporter-Mäuse, in denen spezifische neuronale Populationen und ihre Axone sind beschriftet bezogen werden. Mit diesem Setup können Axone im Laufe der Kollagenmatrix Assay verfolgt werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Kollagen-Matrix-Assay wurde entwickelt und durch die Arbeit von vielen verschiedenen Forschergruppen in den letzten zwei bis drei Jahrzehnten verbessert. Die Ansätze hier für striatalen dopaminergen und Explantate beschriebenen stark aus diesen Studien profitieren. Darüber hinaus möchten die Autoren zu Asheeta Prasad für ihre Hilfe danken, bei der Einrichtung von striatalen Explantatkulturen. Arbeit im Labor wurde von der Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award) gefördert, die Niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und Entwicklung (ZonMw-VIDI und ZonMw-TOP), das Europanian Union (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (zu RJP) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (TopTalent; zu ERES).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA Laboratories | M11-004 | |
| Hepes | VWR international | 441476L | |
| β-Mercapt–thanol | Merck & Co., Inc. | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 61100-087 | |
| Neurobasal | GIBCO, by Life Technologies | 21103-049 | |
| B27 | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez Biologicals | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma-Aldrich | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
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