Summary
Dimostriamo la tecnica di base per progettare molecolare ed evolvere sintetici virale adeno-associati (AAV) vettori di terapia genica attraverso la famiglia shuffling DNA. Inoltre, fornire linee guida generali ed esempi rappresentativi per la selezione e l'analisi delle singole capsidi chimerici con proprietà migliorate sulle cellule bersaglio in coltura o nei topi.
Abstract
Virali adeno-associati (AAV) vettori rappresentano alcuni dei veicoli più potenti e promettenti per il trasferimento del gene terapeutico umano a causa di una combinazione unica di proprietà benefiche 1. Questi includono la apathogenicity dei virus di tipo selvatico sottostanti e le metodologie più avanzate per la produzione di alta titolo di elevata purezza e vettori ricombinanti clinico-grado 2. Un ulteriore vantaggio particolare del sistema di AAV su altri virus è la disponibilità di una ricchezza di natura sierotipi che differiscono nelle proprietà essenziali ancora possono essere facilmente costruiti come vettori usando un protocollo comune 1,2. Inoltre, una serie di gruppi tra cui il nostro ha recentemente messo a punto le strategie per utilizzare questi virus naturali come modelli per la creazione di vettori sintetici, che combinano sia i beni di sierotipi di input, o che esaltano le proprietà di un singolo isolato. Le rispettive tecnologie per raggiungere questi obiettivi are sia DNA shuffling famiglia 3, ossia la frammentazione di vari geni del capside di AAV seguita dalla loro rimontaggio basato su omologie parziali (tipicamente> 80% per la maggior parte sierotipi di AAV), o visualizzare peptide 4,5, inserimento cioè di solito in sette aminoacidi un ciclo esposta del capside virale in cui il peptide idealmente media ri-targeting per un tipo cellulare desiderato. Per il massimo successo, entrambi i metodi sono applicati in un high-throughput di moda in cui i protocolli sono up-scalati per produrre librerie di circa un milione di varianti distinte del capside. Ciascun clone è quindi composto da una combinazione unica di numerosi virus parentale (DNA shuffling approccio) o contiene un peptide distintivo all'interno della stessa dorsale virale (approccio visualizzazione peptide). Il successivo passo finale è iterativa selezione di tale libreria sulle cellule bersaglio, al fine di arricchire per capsidi individuali che soddisfano la maggior parte o idealmente tutti i requisiti del processo di selezione. Quest'ultimo preferibilmente pettineines pressione positiva, come la crescita su un tipo di cellula certo interesse, con la selezione negativa, per esempio, l'eliminazione di tutti i capsidi che reagiscono con gli anticorpi anti-AAV. Questa combinazione aumenta la probabilità che capsidi sintetici sopravvissuti alla selezione corrispondono alle esigenze del data applicazione in un modo che probabilmente non sono stati trovati in ogni naturale AAV isolare. Qui, ci concentriamo sul metodo famiglia DNA shuffling come teoricamente e sperimentalmente più impegnativo delle due tecnologie. Descriviamo e dimostrare tutti i passi essenziali per la generazione e la selezione di librerie mischiate AAV (Fig. 1), e poi discutere le insidie e gli aspetti critici dei protocolli che bisogna essere a conoscenza al fine di avere successo con l'evoluzione molecolare AAV.
Protocol
1. Preparazione del set di plasmide che codifica AAV geni del capside
- Per facilitare la preparazione di routine di quantità sufficienti delle varie capside di AAV (tappo) geni di DNA shuffling successiva, inizialmente subclonare questi geni in una dorsale comune plasmide. È importante comprendere identiche sequenze fiancheggianti di> 20 nucleotidi per un uso successivo come siti di legame del primer nested PCR e per la clonazione (Fig. 2).
- Utilizzando primers appropriati (vedi tabella per i primer esemplari per AAV5), PCR amplificare i geni desiderati dal cap comunemente disponibili plasmidi AAV che di solito contengono il gene rep AAV2 accanto al gene cap di scelta. Poiché il prodotto di PCR verrà utilizzato per la clonazione standard, ~ 1 pg di prodotto purificato è già sufficiente, e qualsiasi protocollo convenzionale PCR può quindi essere utilizzato.
- Digerire la PCR purificato prodotto (ad esempio, utilizzare gel di agarosio di purificazione o di un kit standard di purificazione PCR) edestinatario plasmide con enzimi di restrizione cui riconoscimento siti sono presenti negli inneschi usati per l'amplificazione tappo (1,1) come pure nel ricevente plasmide. Nel nostro laboratorio, usiamo Pac I e Asc I siti (Fig. 2) in quanto sono assenti nella maggior parte dei AAV.
2. DNasi-based Cap frammentazione Gene
- PCR amplificare i geni cap di scelta tra i plasmidi generati nei passaggi 1.1-1.3. Una reazione come descritto qui di seguito produrrà ~ 3 pg di prodotto PCR. A seconda del numero di geni tappo da includere nella libreria, questo basta per un massimo di sei reazioni mischiare.
- Per la PCR, impostare una reazione di 50 microlitri contenente 200 ng cap plasmide, ciascun primer a 2 concentrazione uM finale, 10 microlitri di buffer 5x Hifi e 1 polimerasi ul Hifi. Iniziare con 5 min a 95 ° C e quindi eseguire 40 cicli di 15 sec 94 ° C, 30 sec 57 ° C e 3 min 68 ° C, seguita da una fase finale di 10 min a72 ° C. Purificare i prodotti di PCR tramite gel o kit e quindi impostare una controllata DNase digest per creare frammenti cap gene per la ri-assemblaggio in chimere.
- Pertanto, anche mescolare i vari cap prodotti di PCR per un importo totale di 4 mg in 54 microlitri H 2 O. Aggiungere 6 microlitri tampone di reazione DNasi e 0,5 pl DNasi alla reazione, accuratamente scorri tre volte, ruotare brevemente e immediatamente messo su un blocco riscaldante 25 ° C. Incubare tra 1 e 2 min (impostare più reazioni parallele e terminano in incrementi di 15 sec), quindi arrestare la reazione con l'aggiunta di 6 pl 25 mM EDTA e con una breve vortex e incubare 10 min a 75 ° C.
- Purificare i frammenti tappo su uno standard di gel di agarosio all'1%. Idealmente, uno striscio deve essere visibile tra 100 e 500 paia di basi. Dal momento che DNasi I è un enzima molto potente, la corretta manipolazione ed i tempi sono fondamentali in questa fase, e di molteplici varianti nel tempo di incubazione a passo 2,3 potrebbe essere necessaria per res ottimaliULT (Fig. 3). Purificare il DNA eluito utilizzando un kit standard e determinare la concentrazione.
3. DNA Famiglia Shuffling
- In primo luogo, ri-assemblare i frammenti cap in full-length ausilio di un PCR in cui si auto-prime a base di omologie parziali. Quindi, impostare una reazione di 50 ml con 500 frammenti ng purificato (step 2.4), 10 microlitri di buffer Phusion 10x, 1 pl 10 mM, dNTP 1,5 microlitri DMSO e 0,5 microlitri Phusion polimerasi II. Incubare per 30 sec a 98 ° C e quindi eseguire 40 cicli di 10 sec 98 ° C, 30 sec e 42 ° C 45 sec 72 ° C, seguita da una fase finale di 10 min a 72 ° C.
- In una successiva seconda PCR, amplificare i geni ri-assemblati tappo per la successiva clonazione, utilizzando primer che si legano alle sequenze conservate fiancheggianti (Fig. 2). Pertanto, impostare una reazione di 50 microlitri contenente 2 microlitri del primo PCR (passo 3,1), ciascun primer ad una concentrazione finale di 2 pM, 0,5 pl MgCl2,10 microlitri di buffer 5x Hifi e 1 polimerasi ul Hifi. Si consiglia di eseguire 16-24 PCR per garantire rendimenti sufficientemente elevati per la successiva clonazione. Pool le PCR e purificare l'intera lunghezza della fascia tappo (gel o kit).
- Digerire il purificato piscina gene cap con Pac I e Asc I per la clonazione in un competente per la replicazione di AAV plasmide trasportante AAV ITR (ripetizioni terminali invertite; replica e segnali di imballaggio), nonché il gene rep di AAV2. Quest'ultimo dovrebbe essere seguita da gli stessi siti per ospitare il patrimonio genetico tappo "in frame" (vedi fig. 2 per i dettagli). Per ottenere la completa digestione del prodotto PCR, incubare durante la notte con l'enzima in eccesso.
- Legare i frammenti PAC e la opportunamente tagliata AAV ITR / rep backbone in un rapporto molare di 3:1. Effettuare una 40 microlitri volume totale mastermix (sufficiente per 20 trasformazioni) con una concentrazione di DNA finale di 50 ng / pl e incubare notte a 16 ° C.
- Trasforma reazione di ligazione per miscelazione (su ghiaccio) 2 ml con 30 microlitri elettro-competente E. coli (cresciuto da cellule commerciali e reso competente, utilizzando qualsiasi protocollo standard). Aggiungi nella pre-raffreddati cuvette di elettroporazione (1 gap mm) su ghiaccio. Elettroporare a 1,8 kV, 200 Ω e 25 uF. La costante di tempo dovrebbe essere vicino a 5 ms. Immediatamente aggiungere 1 ml preriscaldata medie SOC e il trasferimento ad un pallone da 250 ml. 20 elettroporazioni tali produrrà una biblioteca con una diversità di circa 1x10 6 cloni diversi.
- Aggiungere 1 volume di pre-riscaldata mezzo SOC alle trasformazioni aggregati e agitare a 37 ° C e 180 rpm per 1 h. Quindi portare il volume totale di 800 ml con mezzo LB più ampicillina (concentrazione finale di 50 pg / ml) e incubare per 16 h altro nelle stesse condizioni. Purificare il DNA plasmidico libreria utilizzando ad es. uno Qiagen Mega kit di preparazione.
Opzionale al passo 3.6: Per calcolare la diversità esatta biblioteca, piastra uno aliquot della soluzione di 800 ml (prima dell'incubazione 16 h) su LB-ampicillina (piastre per esempio, 10 pl su una piastra 10 cm) e colonie conta il giorno successivo. Inoltre, per convalidare elevate efficienze shuffling, ad esempio di sequenza 24 cloni e allinearsi a geni cappuccio parentali (vedi anche fig. 8). Infine, per confermare la vitalità biblioteca e ad alta diversità funzionale, subclone scelto a caso i geni cap in un plasmide helper AAV e li usa per produrre e analizzare i vettori ricombinanti in scala ridotta (figg. 4-5) (vedi anche punto 5.4).
4. Produzione di Biblioteca virale
- Seed 10 15 cm 2 piatti a base di cellule HEK293T (4.5x10 6 celle / piatto) e 48 ore dopo trasfezione con 220 mcg AAV biblioteca e 220 mcg plasmide adenovirale (necessario per la propagazione AAV). Pertanto, pre-riscaldare PEI (polietilenimmina) e 300 mM NaCl a 37 ° C. Quindi mescolare 7,9 ml NaCl e il DNA, e aggiungere H 2 O, per un totale volume del 15,8 ml. In un tubo separato, miscelare 3,52 ml PEI, 7,9 ml e NaCl 4,38 ml H 2 O (tutti i volumi per dieci trasfezioni). Combinare le miscele (vortice) e incubare per 10 min a temperatura ambiente, prima di distribuire uniformemente la soluzione i piatti (3 ml per piastra).
- Dopo 48 h, raschiare le cellule nel mezzo e spin giù a 1200 rpm per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in 6 ml di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 50 mM NaHCO 3) e soggetti a 5 cicli di congelamento-scongelamento (-80/37 ° C). Incubare con 50 U benzonasi per ml per 1 ora a 37 ° C, prima della filatura giù detriti cellulari a 3750 rpm per 20 min.
- Preparare 15%, 25% e 40% (diluizioni con 2,5 microlitri / ml phenolred) da un iodixanolo 60% (OptiPrep in PBS-MK) magazzino in PBS-MK (1x PBS, 1 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl).
- Impostare un gradiente per la purificazione AAV utilizzando una pipetta Pasteur aggiungere 5 ml di sospensione di virus in un Quick-Seal provetta da centrifuga Beckman (14x89 mm), seguiti da 1,5 ml each del 15%, 25% e soluzione iodixanolo 40%. Rabboccare il gradiente con tampone di lisi.
- Ultracentrifuga a 50,000 K per 2 ore a 4 ° C in un rotore Beckman Ti70.1. Poi pulire l'esterno del tubo con 70% etanolo, bastone un ago nella parte superiore del tubo per la ventilazione e disegnare 1,2 ml della frazione iodixanolo 40% usando un ago. Fare attenzione per evitare di attirare dalla frazione del 25% in quanto contiene vuoti capsidi AAV.
5. Screening e selezione
- A questo punto, si può iterativamente amplificare l'intera libreria in cellule coltivate o in animali chimerici fino capsidi esibiscono proprietà desiderate sono emersi (figg. 6-11).
- Per selezionare in cellule in coltura, co-infettare varie aliquote della libreria (ad esempio, 1, 10 e 100 pl) e Adenovirus-5 per sostenere la crescita AAV. Test più varianti di biblioteca e di supporto adenovirale è essenziale come l'infettività di libreria in un dato tipo di cellula non può essere previsto. Raccogliere ilcellule dopo ~ 3 giorni, estrarre AAV amplificate mediante congelamento-scongelamento, inattivare Adenovirus per 30 min a 56 ° C e ri-infettare nuove cellule. Ripetere fino a 5 volte fino a quando capsidi distinte arricchirsi (validazione mediante sequenziamento).
- Per la selezione negli animali, infettare con la biblioteca ed estrarre il tipo desiderato tessuti o cellule ~ dopo 1 settimana. Non co-infettare con Adenovirus ciò causerebbe tossicità negativi negli animali. Rescue DNA virale mediante PCR utilizzando gli stessi primer come in precedenza (Fig. 2), ri-clonare la piscina cap, produrre una libreria nuova e ripetere fino capsidi distinte arricchirsi (validazione mediante sequenziamento).
- Le condizioni precise (volume, titolo, via) per la selezione in vivo dipende il tessuto bersaglio di interesse. Per fegato, i topi sono tipicamente infettati con 1x10 11 a 1x10 12 particelle virali in un volume totale di 200 pl PBS mediante iniezione nella vena della coda (IV). Il fattore limitante è di solito il titolo virale del originapreparazione l, in quanto l'iniezione di 1x10 12 AAV in 200 pl richiede un titolo di almeno 5x10 12 / ml, che non tutti i laboratori può sistematicamente ottenere. Quindi, mentre un titolo massimo è benefico per la prima infezione (perché la biblioteca non è ancora stato arricchito per capsidi efficienti di un determinato tessuto e possono quindi avere un infettività relativamente bassa), si consiglia di utilizzare almeno 1x10 11 particelle per mouse per la selezione del fegato.
- Se i topi sono disponibili più, è molto utile per iniettare numero delle particelle diverse affini alla selezione in cellule in coltura, e di utilizzare diversi topi per gruppo (e poi mettere in comune i fegatini raccolti all'interno di ogni gruppo) al fine di minimizzare la variabilità e di aumentare il successo tariffe, ad esempio, tre topi a 1x10 11 e 3 topi a 1x10 12 particelle.
- Dal momento che AAV è un virus non patogeno e replica-incompetenti (senza helpervirus), non ci sono reazioni avverse da ricercare in assenza di Adenovirus.
- Per euthanization, gli animali sono stati anestetizzato con un vaporizzatore isoflurano e, successivamente, eutanasia tramite dislocazione cervicale.
- I tessuti (fegato in questo caso) sono state raccolte dopo gli animali sono stati confermati eutanasia. In generale, non è necessario anche per altri tessuti a perfondere gli animali o per raccogliere AAV-infetti organi prima della morte, poiché il DNA AAV è stabile e può essere facilmente recuperato da cellule congelate / tessuti.
- Per studiare capsidi singoli dalla libreria (passo 3.6) o dopo la selezione (gradini 5.2-5.3)), produrre vettori AAV che codificano un gene reporter (per esempio, GFP 6) seguendo la procedura 4,1-4,5. Pertanto, clonare il gene cap di interesse in un plasmide helper standard di AAV 2. Al passo 4.1, triple-trasfezione delle cellule con 14,7 mcg ciascuna delle AAV vettore (che codifica il reporter), AAV aiuto e di supporto adenovirale. Infettare le cellule in coltura o animali con il virus purificato in diverse quantità e determinazionene efficienza di trasduzione esempio tramite FACS o microscopia.
6. Risultati rappresentativi
Utilizzo del protocollo descritto qui genere si traduce in biblioteche virali con una varietà di circa 1x10 6 capsidi unici che possono poi essere sottoposti a screening per singole particelle visualizzazione più o tutte le proprietà desiderate su una linea cellulare determinata o in animali. Nel seguito, si fornirà esempi rappresentativi di risultati di tale in vitro o in vivo proiezioni.
Prima di questo, tuttavia, riteniamo importante sottolineare ancora una volta l'utilità di analizzare i singoli cloni dalla libreria originale plasmide per la loro funzionalità e la diversità (opzionale al punto 3.6). Questo perché le ultime due parametri sono massimi requisiti critici per il successo della selezione della libreria virale effettivo che viene realizzato dalla libreria plasmidica. Pertanto, si può scegliere a caso singolo mescolategeni cappuccio e li usa per produrre vettori AAV ricombinanti (estratti grezzi o particelle purificati, a seconda del grado di accuratezza desiderato) che esprimono un gene reporter facilmente rilevabile e quantificabile. Un dosaggio tipico per confrontare le diverse varianti del capside è poi microscopia a fluorescenza, come illustrato nell'esempio rappresentativo in Fig. 4.
Un metodo alternativo è basato su FACS misurazione della espressione del gene reporter fluorescente che detiene i vantaggi aggiuntivi che esso permette anche per la determinazione dell'espressione genica per cella, oltre che funziona per cellule in sospensione. Fig. 5 mostra un tipico risultato di una tale analisi FACS basata su grezzi lisati vettore AAV in vari tipi cellulari.
Poiché la selezione sopra descritta chimere tappi singoli è casuale e limitata, è naturalmente non è utile come un approccio effettivo di arricchimento di candidati desiderati. Invece, la selezione del viBiblioteca ral nelle cellule bersaglio o tessuti negli animali è più appropriato. Poiché le condizioni ei parametri che variano con ogni applicazione, ci sarà solo mettere in evidenza alcune linee guida e dei risultati poco rappresentativi.
Il modo più semplice selezione è iterativo amplificazione biblioteca su linee cellulari coltivate o cellule primarie (punto 5.2). Dal momento che richiede AAV Adenovirus co-infezione per la sua propagazione, le cellule bersaglio deve essere suscettibile di Adenovirus. Si può poi crescere e infettare i loro esempio in piastre da 6 pozzetti che contengono un numero sufficiente di cellule per pozzetto per garantire la piena copertura della biblioteca. Una seconda nozione importante è che l'equilibrio di AAV e Adenovirus è delicato; troppo AAV possono inibire il Adenovirus, mentre un eccesso di quest'ultimo uccidere le cellule (a differenza di AAV, Adenovirus provoca infezioni litiche) prima che i AAV potrebbe replicare.
Tuttavia, poiché l'infettività raccolta di un certo tipo di cellula è sconosciuto, trovando AAV "buono": i rapporti a Adenovirusche entrambi possono propagare richiede parallelo test di varie combinazioni di dosi della libreria e l'helper adenovirale (ad esempio, 10:1, 1:1 e 1:10). Una buona misura per l'infezione da adenovirus potente è il verificarsi di effetti citopatici tre giorni dopo l'inoculo del virus, evidenziata da arrotondamento cellula e distacco come si vede in fig. 6. Viceversa, una lettura utili per AAV infezione e amplificazione è il rilevamento di proteine del capside mediante Western blotting, utilizzando l'anticorpo B1 che riconosce una altamente conservata capside di AAV epitopo (Fig. 7) 7.
Una decisione importante è allora che estrae greggio AAV a raccogliere per la successiva re-infezione di cellule fresche (punto 5.2). Idealmente, vi potrà togliere quelle in cui le bande del capside di AAV sono meno notevole (Fig. 7) perché questi suggeriscono uno stretto legame genotipo-fenotipo. Quest'ultimo descrive la situazione in cui un genoma che codifica una variante capside è determinataeffettivamente confezionato nel capside corrispondente. Per ottenere e mantenere uno stretto legame genotipo-fenotipo è fondamentale per il successo selezione dei singoli candidati virali come a sua volta assicura che capsidi con proprietà desiderate fornire il modello affine genetico all'interno delle cellule durante cicli di infezione successive. Pertanto, si consiglia di scegliere gli estratti grezzi con moderata espressione del capside di re-infezione e ad utilizzare gli importi minimi. Insieme, queste due misure evitare il sovraccarico delle nuove cellule infettate con diversi capside / genoma le combinazioni che potrebbero turbare il genotipo-fenotipo linkage una volta che i re-infettati virus inizia la replica e ri-confezionamento loro genomi in non-affini capsidi.
Inoltre, è fondamentale per monitorare la diversità libreria durante ripetuti cicli infezioni mediante sequenziamento del DNA. Idealmente, si noterà cambiamenti nella composizione del singolo clone indicativi di selezione di successo, vale a dire, accumlazione di frammenti sierotipo distinti e le perdite di altri, come esemplificato in Fig. 8. Nel caso ideale, solo pochi o anche un singolo clone saranno infine rilevato che possono poi essere analizzate come descritto in precedenza. Se, tuttavia, non si osservano cambiamenti dopo quattro o cinque passi, si dovrà o aumentare la pressione di selezione (vedi discussione), o considerare che la linea cellulare usato può essere inappropriato, perché potrebbe essere troppo suscettibile di sierotipi troppi.
Per l'amplificazione della libreria in vivo (passo 5.3), le stesse regole e le considerazioni si applicano, con due differenze fondamentali: in primo luogo, non si fa schermo cloni selezionati casualmente negli animali a causa dei costi associati e le considerazioni etiche. In secondo luogo, non si co-infezione con adenovirus helper in quanto provoca effetti tossici o mortali negli animali, più il tropismo adenovirale limiterebbe selezione alle celle sensibili al virus helper. Invece, la libreria AAV viene infusa thdi e animali, salvati dalle cellule / tessuti bersaglio mediante PCR (Fig. 9) e poi ri-clonato e ri-confezionate per un giro nuova infezione. Come per la selezione in coltura, questo processo viene ripetuto finché singoli candidati sono emersi.
Indipendentemente dalla procedura di selezione, il passo finale è la convalida delle varianti del capside arricchiti nei sistemi appropriati. Figg. 10 e 11 mostrano esempi rappresentativi della nostra propria selezione precedente di chimere AAV che svolgono eccezionalmente bene in colture di tessuti o nel fegato di topi. Come si vede in fig. 10, un clone particolare (AAV-DJ 3) supera infatti un insieme di otto wildtypes AAV naturali in una vasta gamma di linee cellulari. Infine, un altro clone selezionato in linee di epatoma coltivate mostra un tropismo più elevato per il fegato di topo e di conseguenza meno off-targeting quando perifericamente infuso in topi adulti che il potente vettore di controllo AAV8 collaudati in direttaparison (Fig. 11). Si noti che pur essendo più specifico per il fegato, clone AAV-DN trasduce in realtà questo organo un po 'meno efficiente AAV8. A tale riguardo, AAV-DN è un esempio rappresentativo per il buon esito della evoluzione AAV e selezione dove candidati finali hanno normalmente un certo numero di proprietà desiderate, ma non sono necessariamente perfetta in tutti gli aspetti.
Figura 1 Schema:. Sintetico AAV engineering capside attraverso la famiglia rimescolamento del DNA e successiva selezione in cellule o negli animali. Passi del protocollo sono evidenziati in grigio.
Figura 2. AAV cap gene donatore e ricevente plasmidi utilizzati nel nostro laboratorio per la famiglia rimescolamento del DNA e la generazione di biblioteca. Si noti che questi sono solo esempi rappresentativi, e che i siti e le sequenze esattepuò essere personalizzato. Il donatore di base plasmide è derivato dal commercialmente disponibile pBlueScript II KS (+) vettore che progettato per contenere l'associazione innesco indicato come siti di restrizione, rappresentata da frecce o triangoli, rispettivamente. Abbiamo poi clonato i geni cap di AAV sierotipi 1-9 (amplificato con primers capF / R) in questo plasmide, per diventare affiancato da Pac I e Asc I siti di restrizione. Primers T3 e T7 sono utilizzati per l'isolamento tappo nel passaggio 2,2, mentre dopo l'amplificazione di ri-assemblati sequenze chimeriche (passo 3.2) può essere realizzata utilizzando sia coppie di primer SAF / o CUF R / R, o entrambi in uno nested PCR. La replicazione-competenti destinatario plasmide porta ripetizioni terminali invertite (ITR di AAV, la replicazione e segnali di imballaggio) che fiancheggiano il gene rep di AAV2 sotto il controllo del promotore p5 AAV. Pac I e Asc I siti di restrizione a valle di rep permettere "in frame" clonazione del pool di geni mescolate cap. Ilindicati i siti di legame di primer LSEQ sono utili per il sequenziamento del gene cap (fase 3.6).
Figura 3. Esempio DNasi I digest di geni cappuccio (AAV2, 8 e 9). La figura mostra l'analisi elettroforetica su gel di agarosio dei prodotti di gene cap digerisce utilizzando i tempi indicati diversi di incubazione (in minuti: secondi). Corsia U mostra il tappo non digerito piscina ingresso frammento come controllo. Le dimensioni delle bande di DNA marker nelle corsie M sono in kilobasi. In questo esempio, ideale digest sono stati ottenuti con tempi di incubazione di 1:45 o 2:00 min, che ha prodotto il picco preferita predominante circa 100 a 500 paia di basi (giallo).
Figura 4. Esempio di microscopia analisi, basata su tre linee di cellule umane infettate con cinque diversi ricombinante YFP che esprimono ve AAVctors (nomi sopra) realizzati con geni rimescolati cap selezionati in modo casuale da una libreria originale basato su AAV2, 8 e 9.
Figura 5. Esempio di FACS analisi, basata su quattro tipi di cellule infettate (in serie Dieci diluizioni) con 18 diverse YFP ricombinanti che esprimono vettori AAV (nomi in cima, compresi quelli di Fig. 4) ha mescolato con i geni cap scelti a caso da una libreria originale (AAV2, 8 e 9). L'espressione è stata YFP codice colore per una più facile visualizzazione. Percentuali raffigurati sono di cellule trasdotte, per cui il nero indica sempre 0% bianco e il numero più alto misurato in ogni tipo di cellula. B2 Clone (rosso) esemplifica un clone con scarsa efficacia complessiva, come si può aspettare da capsidi non selezionati. Si noti che l'analisi FACS è più sensibile e può essere utilizzato anche per cellule in sospensione (come SupT1) che sono meno suscettibili di microscopia. hu, Umano, mu, murino.
Figura 6. Aspetto tipico di effetti citopatici in cellule (HeLa in questo caso) dopo produttivo co-infezione con AAV e Adenovirus. Le cellule sono state sia a sinistra non infetta (in alto pannello di sinistra) o infettati con gli importi indicati (particelle per cellula) di Adenovirus.
Figura 7. Rilevamento di espressione AAV proteina del capside mediante Western blotting come misura di biblioteca infezione e amplificazione. La macchia a sinistra mostra le cellule co-infettate con diversi volumi (in microlitri) di una libreria helper Adenovirus e AAV. I primi due corsie sono buoni esempi per la cooperazionenditions cedendo appena rilevabile espressione della proteina AAV, indicando sufficiente ma non eccessiva l'infezione AAV e amplificazione e quindi il desiderato stretto legame genotipo-fenotipo. Così, pl 0,1, 1 o 10 di questi surnatanti sono stati utilizzati per la nuova infezione di cellule fresche (blot destra). Le cellule in corsia C sono state infettate con AAV solo come controllo negativo (nessuna espressione rilevabile a causa dell'assenza del helpervirus).
Confronti Figura 8. Di sequenze proteiche sono numeri (amminoacidi) dei cloni di AAV da una libreria basata su AAV2, 8 e 9 prima e dopo la selezione. Sequenze di sopra della linea rossa mostra i AAV parentali. Frecce viola indicano eventi di ricombinazione omologa. La freccia rossa indica un cross-over tra AAV2 e AAV9 notato in tutti i cloni selezionati.
Figura 9. </ Rescue strong> di successo infettato cloni di AAV da tessuti di topo tramite PCR. In questo esempio, i geni di AAV berretto erano PCR-amplificato da fegato di topo estratta una settimana dopo infusione libreria periferico, utilizzando coppia di primer SAF / R (Fig. 2). Lane 1 mostra l'atteso 2,2 kilobasi banda, mentre la corsia 2 è un non-modello di controllo. Dopo Pac I e Asc restrizione io, i frammenti amplificati sono stati ri-clonato nel plasmide destinatario originale (Fig. 2) per la produzione e la successiva reinfusione di una libreria secondaria. Le dimensioni delle bande di DNA marker in M corsie sono indicati in kilobasi.
Figura 10. Esempio di prestazioni superiori di una AAV arricchito chimera in cellule in coltura. Clone AAV-DJ è stata riportata da noi prima 3; rappresenta principalmente un ibrido tra sierotipi di AAV 2, 8 e 9, ed è stato selezionato da un biblioteche y contenente queste tre più cinque sierotipi addizionali in cellule di fegato umano in presenza del pool antisieri umana. Per confrontare l'efficienza di otto sierotipi di AAV naturali (indicata da 1-6, 8 e 9 in alto), tutti i geni tappo sono stati utilizzati per la produzione purificata auto-complementari Gfp-esprimono vettori 8,19. Questi sono stati normalizzati per contenere 2x10 9 genomi vettori per ml e poi utilizzati per trasdurre le linee cellulari mostrate in diluizioni seriali di dieci volte. Tre giorni dopo, GFP-esprimono cellule sono state contate e titoli infettive sono state determinate tenendo conto del fattore di diluizione. In contrasto con il codice in Fig. 5, colori più scuri indicano qui infectivities superiori al numero di particelle. Come è evidente, la scelta AAV-DJ chimera supera tutti wildtypes AAV naturali, esemplificando il successo dello schema di selezione applicati. fibr, fibroblasti, ha, criceto, hu, umane, mu, murini, si, scimmieschi.
Figura 11. Esempio per l'analisi di un AAV selezionato chimera nel fegato di topo. Clone AAV-DN è stato selezionato su cellule di epatoma murine e quindi utilizzato per produrre vettori di espressione ricombinanti luciferasi-8. Vengono mostrati topi rappresentativi (tre per gruppo) una settimana dopo infusione periferico di dosi uguali di questo vettore o un controllo basato su tipo selvatico AAV8, uno dei più potenti noti isolati naturali di fegato di topo 9. Si noti che mentre la AAV-DN clone esprime leggermente meno complesso nel fegato (pannello (I)), è più specifico per questo organo poiché presenta sostanzialmente meno off-targeting in non-tessuti epatici volta che i livelli di espressione di fegato sono stati regolato tramite il software di imaging (pannello (II)).
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Discussion
Qui, abbiamo delineato i passaggi essenziali e le linee guida sperimentali per la AAV capside engineering attraverso la famiglia rimescolamento del DNA e per l'evoluzione in cellule o negli animali. In sostanza, questi protocolli sono versioni standard delle procedure che per primi hanno riportato all'interno del campo AAV nel 2008 3. Mentre una raffica di follow-up da altri studi hanno riportato numerose modifiche ad esempio, 10-13, i siti attuali rappresentano strategie fondamentali che producono risultati riproducibili pur essendo suscettibile di up-scaling e l'adattamento a qualsiasi esigenza.
Nonostante i nostri sforzi per standardizzare l'intera procedura, alcuni passi ancora richiedono approcci trial-and-error-based. Ciò vale in particolare per la frammentazione gene cap dovuto al fatto che DNasi è molto sensibile alle condizioni di reazione, quali il tempo di incubazione (vedere gli esempi in Fig. 3). Abbiamo ottenere i migliori risultati con frammenti di partenza in un intervallo di100 a 500 paia di basi e quindi consiglia di provare varie condizioni DNasi (ad esempio, gli importi dei tempi di incubazione e di enzimi) finché l'immagine gel ricorda i vicoli in scatola in fig. 3.
È altresì possibile standardizzare pienamente le singole fasi durante la selezione della libreria in coltura cellulare. Come accennato, un aspetto critico è l'incertezza circa l'infettività di una nuova biblioteca o di Adenovirus in un dato tipo di cellula, che richiede misure indirette, come il Western blotting descritto. Per puro caso, sulla base della nostra esperienza, trovando "buoni" AAV / Adenovirus volumi inoculazione di solito richiede solo pochi sforzi paralleli.
Considerazioni analoghe valgono per libreria selezione AAV in animali che coinvolge anche idealmente test simultaneo di numerosi parametri (ad esempio, le dosi di libreria virale, punto momento del raccolto dopo l'inoculo, via iniettabile) a causa della mancanza di opzioni sperimentali direttamente predizionet biblioteca di infettività in vivo. Generalmente, è importante notare che la selezione in vivo è di solito molto più fisiologicamente rilevante, per varie ragioni tra la discrepanza tra noto infectivities AAV in vitro e in vivo 3. Inoltre, in evoluzione vivo permette di infondere la libreria nello stesso modo che alla fine sarà utilizzato in ambito clinico. Questo offre la possibilità non solo di arricchire per capsidi che potentemente infettare un tipo cellulare desiderato, ma soprattutto farlo da un percorso di consegna accettabile.
Indipendentemente dal sistema di selezione, in genere ritenere che sia preferibile combinare pressioni positive e negative in quanto aumenterà la possibilità di arricchire i singoli candidati. Una delle ragioni per quest'ultimo è la probabilità che capsidi esclusivamente selezionato sotto pressione positiva (ad esempio, la crescita su un certo tipo di cellula) può ancora potentemente infettare altre cellule condivisione (a) recettore cellulare (s). Una seconda ragione è che il tipo di cellula bersaglio potrebbe già essere vulnerabile ai virus di input diversi dalla libreria, riducendo la possibilità di arricchire capsidi ancora più efficienti in assenza di ulteriori pressione negativa.
Un esempio per quest'ultima che abbiamo usato con successo prima amplificazione è libreria in presenza del pool antisieri umano contenente anticorpi contro sierotipi di AAV che sono prevalenti nella popolazione umana. Diversamente procedure di selezione meno severe applicate in parallelo, soltanto questa combinazione di pressione positiva e negativa permesso di estrarre un singolo clone (AAV-DJ, Fig. 10) da una libreria di circa 7x10 5 varianti 3.
In ogni caso, vogliamo ribadire l'importanza di testare capsidi di piombo più che emergono da uno schema di selezione, e non solo il candidato in alto. In realtà, è ben possibile che il secondo o il terzo la maggior parte dei cloni dominanti sono altrettanto o anche mminerale utile del candidato piombo, e / o può mostrare fenotipi ulteriormente desiderabili per una data applicazione. Noi consigliamo quindi di scegliere sempre almeno due capsidi più dalla lista finale dei candidati dopo il completamento di un protocollo di selezione e il loro studio, come indicato al punto 5.4.
Last but not least, vogliamo ribadire che il DNA shuffling famiglia non è l'unico metodo ingegneristico AAV. Approcci alternativi includono l'introduzione di mutazioni puntiformi casuali in un particolare gene cap di AAV tramite PCR incline all'errore 14,15 nonché la visualizzazione delle librerie peptidiche nelle aree esposte di una AAV specifico capside 4,5. Mentre una discussione completa o confronto di questi approcci si possono trovare altrove 16-18, si può facilmente concludere che in vista di questa pletora di opzioni, il futuro per il settore dell'ingegneria AAV e l'evoluzione è sicuramente molto luminoso e probabilmente ha appena iniziato .
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Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il supporto eccezionale di loro laboratorio, i membri del team e il lavoro del cluster di eccellenza CellNetworks all'Università di Heidelberg così come dalla Chica e Heinz Schaller (CHS) fondazione. Apprezziamo che l'evoluzione molecolare AAV via DNA shuffling famiglia è diventata un campo molto attivo dato che la nostra prima pubblicazione, tre anni fa e quindi chiedere scusa a tutti gli autori di pubblicazioni rilevanti il cui lavoro non potevano essere citati qui a causa di vincoli di spazio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Phusion II polymerase Kit | Finnzymes | F-540S | |
| HotStar Hifi polymerase Kit | Qiagen | 202602 | |
| DMSO | Finnzymes | F-540S (part of kit) | |
| EDTA (25 mM) | Invitrogen | 18068-015 (part of kit) | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | 4855.2 | |
| Ampicilin sodium salt | Carl Roth Gmbh | K029.2 | |
| dNTPs (10 mM, 100 μl) | Invitrogen | 18427013 | |
| Iodixanol (OptiPrep) | Axis-Shield | 1114739 | |
| Phenolred | Merck & Co., Inc. | 107241 | |
| Plasmid mega prep kit | Qiagen | 12181 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | Optima L90K | |
| Quick-Seal centrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 342414 | |
| Electroporation unit | Bio-Rad | GenePulserXcell | |
| Thermal cycler | Eppendorf | Vapo Protect | |
| Heating block | BIOER | MB-102 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | IX81 | |
| FACS analyser | Beckman Coulter Inc. | Cytomics FC500 MLP | |
| MegaX DH10B T1R cells | Invitrogen | C640003 | |
| Benzonase | Merck & Co., Inc. | 101695 | |
| Adenovirus-5 | ATCC | VR-5 | |
| pBlueScript II KS(+) plasmid | Stratagene, Agilent Technologies | 212207 | |
| cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC | IDT | Custom primer | |
| cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC | IDT | Custom primer |
References
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