Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen
Summary
Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.
Abstract
Muis embryonale fibroblasten (MEF) werden gebruikt om menselijke embryonale stamcellen (hESC ') culturen vastgesteld na blastocyst isolatie 1. Deze feeder systeem houdt hESC 's uit die een spontane differentiatie tijdens celexpansie. Echter, deze co-cultuur methode is arbeidsintensief, vereist hoog opgeleid personeel, en de opbrengst lage hESC zuiverheid 4. Vele laboratoria hebben getracht het aantal voedercellen in hESC culturen (dwz waarin matrix beklede schalen of feeder cell types 5-8) te minimaliseren. Deze gemodificeerde kweeksystemen is enige belofte, maar nog niet verdrongen de standaard methode voor het kweken van hESC 's met mitomycine C behandelde muizen embyronic fibroblasten om ongewenste spontane differentiatie van de hESC culturen vertragen. Daarom moet de voedingscellen in hESC expansie worden verwijderd tijdens differentiatie experimenten. Hoewel verschillende technieken beschikbaar voor het zuiveren van hESC colonies (FACS, MACS, of het gebruik van resistente vectoren) van feeders, deze technieken zijn arbeidsintensief, duur en / of destructief voor de hESC. Het doel van dit project was om een methode van zuivering dat de oogst van een zuiverder bevolking van hESC 's maakt uitvinden. We hebben gezien dat in een confluente hESC cultuur, de MEF bevolking kan worden verwijderd met behulp van een eenvoudige en snelle aspiratie van de MEF vel. Deze verwijdering is afhankelijk van verschillende factoren, waaronder laterale cell-to-cell binding van MEFs dat een lagere bindingsaffiniteit voor de styreen kweekschaal hebben en het vermogen van de stamcellen koloniën fibroblasten buiten drukken tijdens de generatie van hun eigen " niche ". De hESC werden daarna onderzocht SSEA-4, Oct3 / 4 en Tra 1-81 tot expressie 10 dagen na verwijdering MEF onderhoud van pluripotentie waarborgen. Bovendien hESC kolonies in staat waren om te blijven groeien uit tot grotere formaties na MEF verwijdering, het verstrekken van een extra niveau van hESC expansie.
Protocol
Discussion
De methode die in dit manuscript biedt een snelle en minder kostbaar alternatief voor het elimineren van fibroblast feeder-cellen uit menselijke embryonale cel culturen. De succesvolle verwijdering van fibroblasten is afhankelijk van het bestaan van een strak confluente monolaag van deze cellen dat zich ontwikkelt in meer stamcelculturen. Na 7-10 dagen, zal de groeiende hESC kolonies druk op de feeder fibroblasten in buitenwaartse richting, het genereren van een steeds dichter wordende fibroblast monolaag tussen k…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een New Faculty Award II van het California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), en een NIH-gefinancierde National Research Award (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
