A remoção rápida de fibroblastos de Alta Densidade Humanos culturas de células estaminais embrionárias
Summary
Apesar dos esforços em curso para as culturas de transição para a alimentação livres de condições, a derivação ea cultura de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) permanecem em grande parte dependente de co-culturas com alimentadores embrionárias (MEFs). Aqui, mostramos uma nova metodologia para a rápida remoção de alimentadores de culturas CTEh antes da experimentação.
Abstract
Fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) foram utilizados para estabelecer células-tronco embrionárias (hESCs) culturas após blastocisto isolamento 1. Este sistema de alimentação mantém hESCs de sofrer diferenciação espontânea durante a expansão de células. No entanto, este método de co-cultura é um trabalho intensivo, requer pessoal altamente treinado, e os rendimentos a pureza hESC baixo 4. Muitos laboratórios têm tentado minimizar o número de células de alimentação em culturas CTEh (isto é, a incorporação da matriz revestidos pratos ou outros tipos de células alimentadoras 5-8). Estes sistemas de cultura modificados têm mostrado alguma promessa, mas não suplantou o método padrão para hESCs cultura com mitomicina C tratados com fibroblastos de rato embyronic a fim de retardar a diferenciação espontânea indesejada das culturas CTEh. Portanto, as células de alimentação utilizados na expansão hESC deve ser removido durante as experiências de diferenciação. Embora várias técnicas disponíveis para a purificação do co hESClonies (FACS, Macs, ou o uso de vetores resistentes aos medicamentos) de alimentadores, estas técnicas são de trabalho intensivo, caro e / ou destruidores para o hESC. O objetivo deste projeto foi o de inventar um método de purificação que permite a colheita de uma população mais pura de hESCs. Temos observado que em uma cultura confluente hESC, a população MEF pode ser removido usando uma aspiração simples e rápida da folha de MEF. Esta remoção é dependente de vários factores, incluindo a ligação de célula-a-célula lateral MEFs que tem uma menor afinidade de ligação para o prato de cultura de estireno, e a capacidade de as colónias de células-tronco para empurrar para fora os fibroblastos durante a geração do seu próprio " nicho ". O hESC foram então examinadas para SSEA-4, Oct3 / 4 e expressão Tra 1-81 até 10 dias após a remoção do MEF para assegurar a manutenção da pluripotência. Além disso, as colônias CTEh foram capazes de continuar crescendo de em formações maiores após a remoção do MEF, proporcionando um nível adicional de expansão hESC.
Protocol
Discussion
O método apresentado neste manuscrito oferece uma alternativa rápida e menos onerosa para eliminar células alimentadoras de fibroblastos humanos de culturas de células embrionárias. A eliminação bem sucedida de fibroblastos é dependente da existência de uma monocamada confluente de firmemente estas células que se desenvolvem em culturas de células estaminais mais longos. Depois de 7-10 dias, as colónias que crescem CTEh vai empurrar os fibroblastos de alimentação numa direcção para fora, gerando uma mono…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma Nova Faculdade Prêmio II do California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), e um NIH-financiado Prêmio Nacional de Pesquisa (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
