הסרת פיברובלסטים מהירה מתרבויות צפיפות גבוהות אדם תאי גזע עובריות
Summary
למרות מאמצים מתמשכים לתרבויות מעבר לתנאי מזין חינם, הגזירה והתרבות של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) יישארו תלוי במידה רבה בשיתוף עם תרבויות ניזונים עובריים של עכבר (MEFs). כאן, אנו מציגים שיטה חדשנית להסרת מתקני האכלה במהירות מתרבויות hESC לפני הניסויים.
Abstract
פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שמשו להקמת תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) תרבויות לאחר בידוד הבלסטוציסט 1. מערכת זו שומרת על מזין hESCs מעובר התמיינות ספונטנית במהלך התרחבות תא. עם זאת, שיטה זו משותפת התרבות היא עבודה אינטנסיבית, דורשת כוח אדם מיומן, וטוהר hESC נמוך תשואות 4. מעבדות רבות ניסו למזער את מספר התאים מזינים בתרבויות hESC (כלומר שילוב מנות מטריצה מצופות או סוגי תאים אחרים מזין 5-8). מערכות תרבות שונות אלו הראו תוצאות מבטיחות, אבל עדיין לא החליפו את השיטה הסטנדרטית לhESCs culturing עם fibroblasts embyronic עכבר C שטופל בmitomycin כדי לעכב בידול ספונטני לא רצוי של תרבויות hESC. לכן, התאים המזינים המשמשים בהרחבת hESC יש להסיר במהלך ניסויי בידול. למרות מספר טכניקות זמינות לטיהור שיתוף hESClonies (FACS, מקים, או שימוש בסמי וקטורים עמידים) ממתקני האכלה, טכניקות אלה הן עבודה אינטנסיביות, יקרים ו / או הרסני לhESC. מטרתו של פרויקט זה הייתה צריך להמציא שיטה לטיהור שמאפשרת הקצירה של אוכלוסייה טהורה של hESCs. אנו מציינים כי בתרבות hESC מחוברת, אוכלוסיית MEF ניתן להסיר באמצעות שאיפה פשוטה ומהירה של גיליון MEF. הסרה זו תלויה במספר גורמים, כולל קשירה לרוחב תא לתא של MEFs שיש זיקה מחייבת נמוכה למנת תרבות סטירן, והיכולת של מושבות תאי הגזע לדחוף את fibroblasts החיצוני בדור שלהם " נישה ". HESC היה אז נבדק לSSEA-4, Oct3 / 4 ו1-81 ביטוי Tra עד 10 ימים לאחר הסרת MEF כדי להבטיח תחזוקה של pluripotency. יתר על כן, מושבות hESC היו מסוגלות להמשיך ולצמוח מהם לתצורות גדולות יותר לאחר הסרת MEF, מתן רמה נוספת של התרחבות hESC.
Protocol
Discussion
השיטה שהוצגה בכתב היד הזה מציעה אלטרנטיבה מהירה וזול יותר לחיסול תאים מזינים פיברובלסטים מתרביות תאים עובריות אנושיות. ההסרה המוצלחת של fibroblasts תלויה בקיומו של monolayer חוזקה confluent של תאים אלה שמתפתחים בתרביות תאי גזע ארוכות יותר. לאחר 7-10 ימים, מושבות hESC הגוברות לדחוף את …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי פקולטה לפרס שני חדשה ממכון קליפורניה לרפואת הרגנרציה (RN2-00921-1), ופרס לאומי למחקר NIH במימון (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
