La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias
Summary
A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.
Abstract
Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) se utilizaron para establecer células madre embrionarias humanas (hESCs) los cultivos tras el aislamiento de blastocisto 1. Este sistema de alimentación mantiene hESCs de someterse a la diferenciación espontánea durante la expansión celular. Sin embargo, este método de co-cultivo es laborioso, requiere de personal altamente capacitado y pureza rendimientos hESC bajo 4. Muchos laboratorios han intentado reducir al mínimo el número de células de alimentación en cultivos de células madre (es decir, la incorporación de la matriz platos recubiertos o otros tipos de células alimentadoras 5-8). Estos sistemas de cultivos modificados han mostrado cierta promesa, pero no han suplantado el método estándar para el cultivo de hESCs con mitomicina C tratados con fibroblastos de ratón embrionaria, con el fin de retardar la diferenciación espontánea no deseada de los cultivos de células madre. Por lo tanto, las células de alimentación utilizados en la expansión de células madre debe ser removido durante experimentos de diferenciación. Aunque se dispone de varias técnicas para purificar el co hESClonies (FACS, Mac, o el uso de vectores resistentes a los fármacos) de los alimentadores, estas técnicas son mano de obra intensiva, costosa y / o contrarios a la hESC. El objetivo de este proyecto era inventar un método de purificación que permite la recolección de una población pura de hESCs. Hemos observado que en un cultivo confluente hESC, la población MEF se puede eliminar mediante una aspiración simple y rápido de la hoja de MEF. Esta eliminación es dependiente de varios factores, incluyendo lateral de célula a célula de unión de MEFs que tienen una menor afinidad de unión a la placa de cultivo de estireno, y la capacidad de las colonias de células madre para empujar los fibroblastos hacia el exterior durante la generación de su propio " nicho ". El hESC fueron examinados por SSEA-4, Oct3 / 4 y expresión Tra 1-81 hasta 10 días después de la eliminación del MEF para asegurar el mantenimiento de la pluripotencia. Por otra parte, las colonias de células madre fueron capaces de continuar creciendo en grandes formaciones de después de la eliminación MEF, que proporciona un nivel adicional de expansión hESC.
Protocol
Discussion
El método presentado en este manuscrito ofrece una alternativa rápida y menos costosa para la eliminación de células alimentadoras de fibroblastos humanos de cultivos de células embrionarias. La eliminación exitosa de los fibroblastos es dependiente de la existencia de una monocapa confluente herméticamente de estas células que se desarrolla en más cultivos de células madre. Después de 7-10 días, las colonias que crecen hESC empujará los fibroblastos de conexión en una dirección hacia fuera, la generació…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por una Nueva Facultad II Premio del Instituto de Medicina Regenerativa de California (RN2-00921-1), y un premio financiado por los NIH de Investigación Nacional (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
