Быстрое удаление фибробластов с высокой плотностью эмбриональных стволовых клеток культур
Summary
Несмотря на предпринимаемые усилия по переходу культур подачи без условий, получение и культуру человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) по-прежнему во многом зависит от совместных культурах с мышиных эмбриональных фидеров (МЭФ). Здесь мы покажем новую методологию для быстрого удаления фидеров от чЭСК культур до экспериментов.
Abstract
Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), были использованы для создания человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) культур после бластоцисты изоляции 1. Эта система поддерживает подачи ЭСК от прохождения спонтанной дифференцировки в процессе клеточного роста. Тем не менее, это сотрудничество культуру метод трудоемкий, требует высококвалифицированного персонала, и дает низкую чистоту чЭСК 4. Во многих лабораториях пытались свести к минимуму количество фидерных клеток в культуре ЭСК (т.е. включающие матрицы покрытием блюда или другие устройства подачи типы клеток 5-8). Эти изменения системы культуры показали некоторые надежды, но не вытеснил стандартный метод культивирования ЭСК митомицином С обработанной фибробластов мыши embyronic для того, чтобы замедлить нежелательные спонтанную дифференцировку ЭСК культур. Таким образом, фидерных клеток, используемых в чЭСК расширения должны быть удалены в процессе дифференцировки экспериментов. Хотя несколько методов, доступных для очистки чЭСК сотрудничестваlonies (FACS, Mac, или использование лекарственной устойчивостью векторов) от кормушки, эти методы являются трудоемкими, дорогостоящими и / или разрушительной для ЭСК. Целью этого проекта было придумать способ очистки, который позволяет уборки чище населения ЭСК. Мы обнаружили, что в сливной культуре ЭСК, население MEF могут быть удалены с помощью простого и быстрого стремления лист MEF. Это удаление зависит от нескольких факторов, включая боковые клетки к клетке связывания MEFs, которые имеют более низкое сродство к стирола блюдо культуры, а также возможность колоний стволовых клеток нажать на фибробласты наружу во время создания своего собственного " нишу ". ЧЭСК затем были исследованы на SSEA-4, Oct3 / 4 и Тра 1-81 выражении до 10 дней после удаления MEF для обеспечения поддержания плюрипотентности. Кроме того, ЭСК колонии были в состоянии продолжать расти с в более крупные образования после удаления MEF, обеспечивая дополнительный уровень чЭСК расширения.
Protocol
Discussion
Метод, представленный в этой рукописи предлагает быстрое и менее дорогостоящей альтернативой ликвидации фибробластов подачи из человеческих эмбриональных клеточных культурах. Успешное удаление фибробластов зависит от существования тесно сливающийся монослой из этих клеток, котор?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Новый факультет премии II из Калифорнийского института регенеративной медицины (RN2-00921-1), и NIH-финансируемые Национальной премии исследований (F32-HL104924)
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.
References
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Thomas, R. J. Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).
- Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture. J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).
- Hovatta, O. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).
- McKay, T. R. Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc. Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Stein, G. S., Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. . Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. , (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 .
