Несмотря на предпринимаемые усилия по переходу культур подачи без условий, получение и культуру человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) по-прежнему во многом зависит от совместных культурах с мышиных эмбриональных фидеров (МЭФ). Здесь мы покажем новую методологию для быстрого удаления фидеров от чЭСК культур до экспериментов.
Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), были использованы для создания человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) культур после бластоцисты изоляции 1. Эта система поддерживает подачи ЭСК от прохождения спонтанной дифференцировки в процессе клеточного роста. Тем не менее, это сотрудничество культуру метод трудоемкий, требует высококвалифицированного персонала, и дает низкую чистоту чЭСК 4. Во многих лабораториях пытались свести к минимуму количество фидерных клеток в культуре ЭСК (т.е. включающие матрицы покрытием блюда или другие устройства подачи типы клеток 5-8). Эти изменения системы культуры показали некоторые надежды, но не вытеснил стандартный метод культивирования ЭСК митомицином С обработанной фибробластов мыши embyronic для того, чтобы замедлить нежелательные спонтанную дифференцировку ЭСК культур. Таким образом, фидерных клеток, используемых в чЭСК расширения должны быть удалены в процессе дифференцировки экспериментов. Хотя несколько методов, доступных для очистки чЭСК сотрудничестваlonies (FACS, Mac, или использование лекарственной устойчивостью векторов) от кормушки, эти методы являются трудоемкими, дорогостоящими и / или разрушительной для ЭСК. Целью этого проекта было придумать способ очистки, который позволяет уборки чище населения ЭСК. Мы обнаружили, что в сливной культуре ЭСК, население MEF могут быть удалены с помощью простого и быстрого стремления лист MEF. Это удаление зависит от нескольких факторов, включая боковые клетки к клетке связывания MEFs, которые имеют более низкое сродство к стирола блюдо культуры, а также возможность колоний стволовых клеток нажать на фибробласты наружу во время создания своего собственного " нишу ". ЧЭСК затем были исследованы на SSEA-4, Oct3 / 4 и Тра 1-81 выражении до 10 дней после удаления MEF для обеспечения поддержания плюрипотентности. Кроме того, ЭСК колонии были в состоянии продолжать расти с в более крупные образования после удаления MEF, обеспечивая дополнительный уровень чЭСК расширения.
Метод, представленный в этой рукописи предлагает быстрое и менее дорогостоящей альтернативой ликвидации фибробластов подачи из человеческих эмбриональных клеточных культурах. Успешное удаление фибробластов зависит от существования тесно сливающийся монослой из этих клеток, котор?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа финансировалась Новый факультет премии II из Калифорнийского института регенеративной медицины (RN2-00921-1), и NIH-финансируемые Национальной премии исследований (F32-HL104924)
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblast Marker |
Dapi | Calbiochem | 268298 | Cell Nucleus Marker |
SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Early Differentiation Marker |
Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Table 1. Table of specific reagents used for immunostaining the hESC.