Het meten van voortgang van de celcyclus Kinetics met metabolische labeling en Flow cytometrie
Summary
Bijhouden kleine veranderingen in de progressie en kinetiek van celcyclus stadia worden door gebruik van een combinatie van metabolische labeling van nucleinezuren met BrdU en totaal genomisch DNA kleuring via propidium jodide. Deze methode wordt voorkomen dat van de chemische synchronisatie van fietsen cellen, waarbij de introductie van niet-specifieke DNA-schade die op zijn beurt invloed celcyclus.
Abstract
Nauwkeurige controle van de inleiding, het doorlopen van de verschillende fasen van de celcyclus zijn van het grootste belang in prolifererende cellen. Celcyclus divisie is een integraal onderdeel van de groei en voortplanting en deregulering van de belangrijkste celcyclus componenten zijn betrokken bij de precipiterende gebeurtenissen van carcinogenese 1,2. Moleculaire agenten in anti-kanker therapieën vaak richten op biologische routes die verantwoordelijk zijn voor de regulering en de coördinatie van de celcyclus divisie 3. Hoewel celcycluskinetiek algemeen afhankelijk van celtype is de verdeling van cellen tussen de vier stadia van de celcyclus is vrij consistent binnen een cellijn te wijten aan de patroon mitogeen en groeifactor expressie. Genotoxische gebeurtenissen en andere cellulaire stressfactoren kan een tijdelijke blok celcyclusprogressie, waardoor arrestatie of een tijdelijke onderbreking in een bepaalde fase van de celcyclus mogelijk te maken instellingenplichting van de juiste reactie mechanisme.
De mogelijkheid om experimenteel observeren het gedrag van een celpopulatie met betrekking tot hun voortgang van de celcyclus fase is een belangrijke stap vooruit in de celbiologie. Gemeenschappelijke procedures zoals mitotische af te schudden, differentieel centrifugeren of flowcytometrie op basis van sorteren worden gebruikt om cellen te isoleren in specifieke fasen van de celcyclus 4-6. Deze gefractioneerd fase van de celcyclus verrijkte populaties vervolgens onderworpen aan een experimentele behandeling. Opbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid van de gescheiden fracties kunnen vaak in gevaar worden gebracht met behulp van deze fysieke scheiding methoden. Eveneens, kan de tijd die verstrijkt tussen de scheiding van de cel bevolking en de start van de experimentele behandeling, waarbij de gefractioneerde cellen kunnen evolueren van de geselecteerde cel cyclus fase, vormen belangrijke uitdagingen in de succesvolle implementatie en interpretatie van deze experimenten.
Andere benaderingen van stUdy celcyclus fasen omvatten het gebruik van chemicaliën om cellen te synchroniseren. Behandeling van cellen met chemische remmers belangrijke metabolische processen voor elke celcyclus fase nuttig bij het blokkeren van de progressie van de celcyclus de volgende fase. Bijvoorbeeld, de ribonucleotidereductase remmer hydroxyurea stopt cellen in de G1 / S moment door het beperken van deoxynucleotiden, de bouwstenen van DNA. Andere belangrijke chemicaliën omvatten behandeling met aphidicolin, een polymerase alfa-inhibitor voor G1 arrestatie behandeling met colchicine en nocodazole, beide verstoren mitotische spindel vorming stoppen cellen M en tot slot de behandeling met de DNA ketenterminator 5 fluorodeoxyridine te leiden S-fase arrestatie 7-9. Behandeling met deze stoffen is een doeltreffend middel synchroniseren een gehele populatie van cellen in een bepaalde fase. Met het verwijderen van de chemische, cellen opnieuw de celcyclus in koor. Behandeling van het testmiddel volgende releasevan de celcyclus blokkeren chemische zodat het geneesmiddel zou opleveren is van een uniform celcyclus stadium-specifieke populatie. Echter, omdat veel van de chemische synchronizers bekende genotoxische stoffen, plagen elkaar de deelname van de verschillende bestrijdingsstrategieën wegen (op de synchronizers vs de test agenten) is een uitdaging.
Hier beschrijven we een metabolische labeling methode voor het volgen van een subpopulatie van actief delende cellen door middel van hun progressie van de DNA-replicatie fase, tot en met de verdeling en de scheiding van hun dochter cellen. In combinatie met flowcytometrie kwantificering, dit protocol maakt voor het meten van kinetische progressie van de celcyclus in de afwezigheid van een mechanisch of chemisch-geïnduceerde cellulair benadrukt vaak geassocieerd met andere celcyclus synchronisatie methodologieën 10. In de volgende paragrafen bespreken we de methodologie, evenals een aantal van haar toepassingen in biomedisch onderzoek.
Protocol
Discussion
Door het combineren van flowcytometrie met BrdU incorporatie, hebben we de nodige tools om kinetiek van de celcyclus te bestuderen. De kenmerkende eigenschap van BrdU om te functioneren als een analoog van thymidine is wat zorgt voor een DNA-inhoud kwantificering van een fiets-cel. De opname van BrdU in steeds dochter DNA tijdens de synthese fase van de celcyclus is wat het mogelijk is een subpopulatie van delende cellen volgen door de replicatie van DNA in S fase, gedurende groei G2 en uiteindelijk celdeling . Dochter …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Andy Johnson van de Biomedical Research Center at UBC voor hulp bij FACS-analyse. Cancer Research financiering in de Wong laboratorium wordt geleverd door de Canadian Cancer Society Research Institute (exploitatiesubsidie # 019250), en van O Herbelegging fondsen van de Faculteit Farmaceutische Wetenschappen, UBC. JMYW wordt ondersteund door de Canada Research voorzitters en de Michael Smith Foundation for Health Research Career Development-programma's.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
