Medindo a progressão do ciclo celular Cinética com marcação metabólica e Citometria de Fluxo
Summary
Controlando mudanças subtis na progressão e cinética de fases do ciclo celular pode ser conseguida pelo uso de uma combinação de marcação metabólica de ácidos nucleicos com BrdU e coloração do ADN genómico total de via iodeto de propídio. Este método evita a necessidade de sincronização química de células de bicicleta, impedindo assim que a introdução de não-específica danos no ADN, que por sua vez afecta a progressão do ciclo celular.
Abstract
O controle preciso do início e progressão subseqüente através das diversas fases do ciclo celular são de suma importância na proliferação das células. Divisão do ciclo celular é uma parte integrante do crescimento ea reprodução e desregulação de componentes de ciclo-chave de células têm sido implicados nos eventos precipitantes de 1,2 carcinogénese. Agentes moleculares em terapias anti-câncer freqüentemente alvo vias biológicas responsáveis pela regulação e coordenação da divisão celular ciclo 3. Embora cinética do ciclo celular tendem a variar de acordo com o tipo de célula, a distribuição das células entre as quatro fases do ciclo celular é bastante consistentes dentro de uma linha de células particular devido ao padrão consistente de mitogénio e expressão do factor de crescimento. Eventos genotóxicos e outros estressores celulares pode resultar em um bloqueio temporário de progressão do ciclo celular, resultando em prisão ou uma pausa temporária em uma fase particular do ciclo celular para permitir a instituiçãogação de o mecanismo de resposta apropriada.
A capacidade de experimentalmente observar o comportamento de uma população de células com referência à sua fase de progressão do ciclo celular é um avanço importante na biologia celular. Procedimentos comuns, tais como mitótico sacudir, centrifugação diferencial ou a triagem de citometria de fluxo com base são usadas para isolar células em fases específicas do ciclo celular 4-6. Estes fraccionado, do ciclo celular fase enriquecidas populações são então submetidas a tratamentos experimentais. Pureza, o rendimento ea viabilidade das fracções separadas podem muitas vezes ser comprometida usando estes métodos de separação física. Como assim, o lapso de tempo entre a separação das populações de células e do início do tratamento experimental, no qual as células fraccionadas pode progredir a partir da fase seleccionado do ciclo celular, pode representar desafios significativos na aplicação bem sucedida e interpretação destas experiências.
Outras abordagens para stestágios do ciclo de UDy celulares incluem o uso de produtos químicos para sincronizar as células. O tratamento de células com inibidores químicos de chave processos metabólicos para cada fase do ciclo celular são úteis no bloqueio da progressão do ciclo celular para a fase seguinte. Por exemplo, os ribonucleótidos redutase células hidroxiureia suspende na conjuntura G1 / S através da limitação do fornecimento de desoxinucleótidos, os blocos de construção de DNA. Outros produtos químicos notáveis incluem o tratamento com afidicolina, um inibidor da alfa-polimerase para detenção G1, o tratamento com colchicina e Nocodazole, ambos os quais interferem com a formação do fuso mitótico para suspender as células em fase M e finalmente, o tratamento com o DNA de cadeia terminador 5-fluorodeoxyridine para iniciar S prisão fase 7-9. O tratamento com estas substâncias químicas é um meio eficaz de sincronização uma população inteira de células a uma fase particular. Com a remoção do produto químico, as células se juntar o ciclo celular em uníssono. Tratamento da liberação seguinte teste agentea partir da química do ciclo celular de bloqueio assegura que a resposta à droga eliciada é de um uniforme, do ciclo celular população fase-específica. No entanto, uma vez que muitos dos sincronizadores químicos são conhecidos compostos genotóxicos, provocando além da participação das vias de resposta diferentes (aos sincronizadores contra os agentes de teste) é um desafio.
Aqui nós descrevemos um método de marcação metabólica para seguir uma subpopulação de células ativamente de bicicleta através da sua progressão desde a fase de replicação do DNA, através da divisão e separação de suas células filhas. Juntamente com a quantificação de citometria de fluxo, este protocolo permite para a medição da progressão cinética do ciclo celular na ausência de qualquer mecanicamente ou quimicamente induzida celular salienta geralmente associado com outras células metodologias de ciclo de sincronização 10. Nas seções seguintes vamos discutir a metodologia, bem como algumas de suas aplicações em pesquisa biomédica.
Protocol
Discussion
Através da combinação de citometria de fluxo com incorporação de BrdU, temos as ferramentas necessárias para estudar a cinética do ciclo celular. A propriedade distintiva de BrdU para funcionar como um análogo da timidina é o que permite a quantificação de ADN conteúdo de uma célula de ciclismo. A incorporação de BrdU em uma fita crescente filha ADN durante a fase de síntese do ciclo celular é o que permite uma a seguir uma subpopulação de células de ciclismo através da replicação de ADN em fase S…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Andy Johnson, do Centro de Pesquisa Biomédica da UBC para a assistência com a análise FACS. Financiamento de Pesquisa do Câncer no Laboratório de Wong é fornecido pelo Canadian Cancer Society Research Institute (subvenção de funcionamento # 019250) e de fundos de pesquisa de reinvestimento da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UBC. JMYW é apoiado pelos presidentes de Pesquisa do Canadá ea Fundação Michael Smith para Pesquisa em Saúde programas de desenvolvimento de carreira.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
