Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso
Summary
Monitoraggio sottili cambiamenti nella progressione e cinetica di fasi del ciclo cellulare può essere realizzata mediante l'uso di una combinazione di marcatura metabolica di acidi nucleici con BrdU e DNA genomico totale colorazione tramite ioduro di propidio. Questo metodo evita la necessità di sincronizzazione chimica del ciclo cellulare, impedendo l'introduzione di non-specifico danno al DNA, che a sua volta influisce progressione del ciclo cellulare.
Abstract
Controllo preciso di inizio e la progressione successiva attraverso le varie fasi del ciclo cellulare sono di fondamentale importanza in cellule proliferanti. Ciclo di divisione cellulare è parte integrante della crescita e la riproduzione e deregolamentazione dei componenti chiave del ciclo cellulare sono stati implicati negli eventi scatenanti di 1,2 carcinogenesi. Agenti molecolari in terapie anti-cancro spesso bersaglio vie biologiche responsabili della regolamentazione e il coordinamento della divisione del ciclo cellulare 3. Sebbene cinetica del ciclo cellulare tendono a variare in base al tipo di cellula, la distribuzione delle celle tra le quattro fasi del ciclo cellulare è piuttosto consistente in una linea cellulare particolare grazie al modello di costante mitogeni e espressione di fattore di crescita. Eventi genotossici ed altri fattori di stress cellulare può risultare in un blocco temporaneo di progressione del ciclo cellulare, con conseguente arresto temporaneo o una pausa in una particolare fase del ciclo cellulare per consentire istituzionigazione del meccanismo di risposta adeguata.
La capacità di osservare sperimentalmente il comportamento di una popolazione di cellule con riferimento alla fase progressione del ciclo cellulare è un importante progresso in biologia cellulare. Procedure comuni come mitotico scrollarsi di dosso, centrifugazione differenziale o citometria a flusso basato ordinamento vengono utilizzati per isolare le cellule in specifici momenti del ciclo cellulare 4-6. Questi frazionati, ciclo cellulare fase arricchiti popolazioni vengono poi sottoposti a trattamenti sperimentali. Resa, la purezza e la vitalità delle frazioni separate possono spesso essere compromessa usando questi metodi di separazione fisici. Inoltre, l'intervallo di tempo tra la separazione delle popolazioni cellulari e l'inizio del trattamento sperimentale, la quale le cellule frazionati può passare dallo stadio selezionato ciclo cellulare, può creare problemi rilevanti il successo e l'interpretazione di questi esperimenti.
Altri approcci alla stUdy fasi del ciclo cellulare includono l'uso di prodotti chimici per sincronizzare le cellule. Il trattamento delle cellule con inibitori chimici di chiave processi metabolici per ogni fase del ciclo cellulare sono utili nel bloccare la progressione del ciclo cellulare alla fase successiva. Ad esempio, i ribonucleotide reduttasi idrossiurea cellule arresta a G1 / S frangente limitando la fornitura di deossinucleotidi, i blocchi di costruzione di DNA. Altre sostanze chimiche importanti includono il trattamento con afidicolina, un inibitore di alfa polimerasi per l'arresto G1, il trattamento con colchicina e nocodazole, entrambi interferire con la formazione mitotica mandrino per arrestare le cellule in fase M e, infine, il trattamento con il DNA catena terminatore 5-fluorodeoxyridine di avviare S arresto di fase 7-9. Il trattamento con queste sostanze è un mezzo efficace di sincronizzazione un'intera popolazione di cellule ad una fase particolare. Con la rimozione della sostanza chimica, le cellule rientrare nel ciclo cellulare all'unisono. Trattamento della seguente comunicato di prova agentedalla chimica ciclo cellulare bloccando assicura che la risposta farmaco sollecitato è da un uniforme, ciclo cellulare stadio-specifico popolazione. Tuttavia, poiché molti dei sincronizzatori chimiche sono noti composti genotossici, prendere in giro a parte la partecipazione di vari percorsi di risposta (per i sincronizzatori contro gli agenti di test) è una sfida.
Qui si descrive un metodo metabolico etichettatura per seguire una sottopopolazione di cellule attivamente in bicicletta attraverso la loro progressione dalla fase di replicazione del DNA, attraverso la divisione e la separazione delle loro cellule figlie. Accoppiato con quantificazione citometria a flusso, questo protocollo permette per la misurazione della cinetica progressione del ciclo cellulare in assenza di una meccanicamente o chimicamente cellulare indotta sottolinea comunemente associati con altre metodologie ciclo cellulare di sincronizzazione 10. Nelle sezioni seguenti si discuterà la metodologia, così come alcune delle sue applicazioni nella ricerca biomedica.
Protocol
Discussion
Grazie alla combinazione di citometria a flusso con incorporazione di BrdU, abbiamo gli strumenti necessari per studiare cinetica del ciclo cellulare. La proprietà caratteristica di BrdU per funzionare come un analogo della timidina è ciò che permette di quantificare il contenuto di DNA di una cellula bicicletta. L'incorporazione di BrdU in un filamento figlia crescente DNA durante la fase di sintesi del ciclo cellulare è quello che permette di seguire una sottopopolazione di cellule bicicletta attraverso la rep…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Andy Johnson del Centro di Ricerca Biomedica presso la UBC per l'assistenza con l'analisi FACS. Finanziamento della ricerca sul cancro in laboratorio Wong è fornito dalla Canadian Cancer Society Research Institute (sovvenzione di funzionamento # 019250) e dal reinvestimento dei fondi di ricerca della Facoltà di Scienze Farmaceutiche, UBC. JMYW è supportato da sedie di ricerca del Canada e la Fondazione Michael Smith carriera di ricerca per i programmi di sviluppo della salute.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
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