Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm
Summary
Hücre döngüsü aşamaları ilerleme ve kinetikleri izleme ince değişiklikler Propidium iyodid ile BrdU ve toplam genomik DNA boyama yöntemi ile, nükleik asit metabolik etiketlenmesi bir kombinasyonu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, dolayısıyla da hücre siklus progresyonu etkileyen non-spesifik DNA hasarına, geliştirilmesinin önlenmesi, bisiklet hücrelerin kimyasal senkronizasyonu ihtiyacını ortadan kaldırır.
Abstract
Hücre döngüsünün çeşitli aşamalarında başlaması ve sonraki ilerleme Hassas kontrol hücreleri prolifere olarak büyük öneme sahiptir. Hücre döngüsü bölünmesi, büyüme ve önemli hücre döngüsü bileşenlerinin üretimi ve deregülasyon karsinogenez 1,2 tetikleyici faktörler sorumlu tutulmuştur ayrılmaz bir parçasıdır. Anti-kanser tedavileri Moleküler ilaçlar sıklıkla hücre döngüsü bölünmesi 3 düzenlenmesi ve koordinasyonundan sorumlu biyolojik yollar hedef. Hücre döngüsü kinetikleri hücre türüne göre değişir olmalarına rağmen, hücre döngüsünün dört aşamada arasında hücrelerinin dağılımını mitojen ve büyüme faktörü ifade tutarlı bir desenine bağlı olarak, belirli bir hücre hattı içinde daha çok tutarlıdır. Genotoksik olayları ve diğer hücre-stres katali için izin vermek için yakalanması veya belirli bir hücre döngüsü aşamasında geçici bir duraklama sonuçlanan, hücre döngüsü progresyon geçici blok sonuçlanabiliruygun tepki mekanizması kolayca dolaşmak mümkündür.
Deneysel olarak da hücre döngüsü ilerleme aşamasında referans ile bir hücre popülasyonunun davranışlarını gözlemlemek için yeteneği hücre biyolojisinde önemli bir ilerlemedir. Gibi mitotik olarak ortak prosedürlerin hücre döngüsü 4-6 belirli aşamalarında hücrelerin izole etmek için kullanılır, diferansiyel santrifüj veya akım sitometri tabanlı sıralama kurtulamıyorum. Bunlar, fraksiyonlara, hücre döngüsü faz daha sonra popülasyonlar zenginleştirilmiş deneysel tedavi tabi tutulur. Ayrılmış fraksiyonların Verim, saflık ve canlılık sıklıkla bu fiziksel ayırma yöntemleri kullanarak tehlikeye girebilir. Aynı zamanda, hücre popülasyonlarının ayırma ve fraksiyonlara hücreleri seçili hücre döngüsü aşamasından ilerleyebilir sayede deneysel tedavi başlangıcı arasındaki zaman atlamalı, başarılı bir şekilde uygulanması ve bu deneylerin yorumunda önemli sorunlar oluşturabilmektedir.
St diğer yaklaşımlarKamuoyu iliĢkileri programları hücre döngüsü aşamalarında hücreleri senkronize etmek kimyasalların kullanımını içerir. Her bir hücre döngüsü aşaması için anahtar metabolik işlemler kimyasal inhibitörleri ile hücre tedavisi sonraki aşamaya hücre döngüsünün ilerlemesini engelleme faydalıdırlar. Örneğin, tarafından G1 / S kavşakta ribonükleotid redüktaz inhibitörü hidroksiüre durur hücreleri deoxynucleotides, DNA'nın yapıtaşlarını tedarik sınırlayıcı. Diğer önemli kimyasallar aphidicolin tedavisi dahil, mitotik iğ oluşumunu engelleyebilir, her ikisi de G1 tutuklama polimeraz alfa inhibitörü, kolşisin ve Nokodazol ile tedavi, M fazındaki hücrelerin durdurmak için ve nihayet, DNA zinciri terminatör 5-fluorodeoxyridine ile tedavi başlatmak için S fazı tutuklama 7-9. Bu kimyasallar ile tedavi belirli bir aşamasında hücre bütün bir nüfusun eşitleyerek etkili bir araçtır. Kimyasal kaldırılması ile, hücreler ağızdan hücre döngüsü katın. Test maddesi aşağıdaki sürümü Tedavisihücre döngüsü engelleme kimyasal noktalarında ortaya çıkan madde, bir yanıt üniform, hücre döngüsü aşaması spesifik popülasyondan olmasını sağlar. Ancak, kimyasal eşzamanlayıcılar birçok beri meydan okuyor çeşitli yanıt yollar (test ajanlar vs synchronizers için) katılımı dışında alay, genotoksik bilinen bileşiklerdir.
Burada bölünme ve kızları hücre bölünmeye kadar, DNA'nın kopyalanması aşamasında onların ilerlemesini aktif olarak bisiklet hücrelerinin bir alt takip etmek için metabolik bir etiketleme yöntemi açıklar. Sitometrisi miktar ile birleştiğinde, bu protokol yokluğunda hücre döngüsü kinetik ilerleme ölçümü için olanak ya mekanik veya kimyasal kaynaklı hücresel genellikle diğer hücre döngüsü senkronizasyon metodolojiler 10 ile ilişkili olduğunu vurguluyor. Aşağıdaki bölümlerde biz de biyomedikal araştırmalarda bazı uygulamalarını olarak, metodoloji tartışacağız.
Protocol
Discussion
BrdU eklenmesi ile akım sitometri birleştirerek, hücre döngüsü kinetiğini incelemek için gerekli araçlara sahip. Bir timidin analoğu olarak işlev BrdU en ayırt edici özelliği bir bisiklet hücrenin DNA içeriği ölçümü için olanak budur. Hücre siklusu sentez aşamasında büyüyen bir kızı DNA zincir haline BrdU ile birleşmesiyle bir G2 büyüme dönemi ve sonuçta hücre bölünmesi, S fazında DNA çoğaltma yoluyla bisiklet hücrelerinin bir alt izlemenizi sağlar nedir . BrdU etiketin sinyal s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz FACS analizi ile yardım için at UBC Biyomedikal Araştırma Merkezi Andy Johnson teşekkür ederim. Wong Laboratuvar Kanser Araştırma Fonu Kanada Kanser Topluluğu Araştırma Enstitüsü (işletme hibesi # 019250) tarafından ve İlaç Bilimleri, UBC Fakültesi Araştırma yeniden yatırım fonlarından sağlanır. JMYW Kanada Araştırma Sandalyeler ve Sağlık Araştırması Kariyer Geliştirme programları için Michael Smith Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
