신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정
Summary
세포주기 단계의 진행과 속도론의 추적 미묘한 변화는 Propidium 요오드화물의를 통해 BrdU 및 전체 게놈의 DNA의 염색법과 핵산의 대사 라벨링의 조합을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 방법은이를 차례로 세포주기의 진행에 영향을 미치는가 아닌 특정의 DNA 손상의 도입을 방지, 자전거 전지의 화학 동기화의 필요성을 방지합니다.
Abstract
세포주기의 여러 단계를 거치 개시 및 이후 진행 정밀 제어는 세포를 proliferating의 파라마운트 중요하다. 세포주기 부문의 성장과 주요 세포주기의 구성 요소 복제 및 규제 완화가 carcinogenesis 1,2의 precipitating 사건에 연루되었을의 중요한 부분입니다. 안티 – 암 치료의 분자 에이전트는 자주 셀 사이클 부문 3 규제와 조정을 담당 생물 학적 경로를 타겟. 세포주기 운동은 세포 종류에 따라 다릅니다하는 경향이 있지만, 세포주기의 4 단계 사이 세포의 분포 mitogen과 성장 인자의 표현의 일관된 패턴으로 인해 특정 세포주 내에서 다소 일관성이다. Genotoxic 이벤트 및 기타 세포의 스트레스는 insti 가능하도록하기 위해서 체포 또는 특정 세포주기 단계에서 일시 정지가 발생, 세포주기 진행의 임시 블록이 발생할 수적절한 응답 메커니즘 gation.
실험적으로 자신의 세포주기의 진행 단계에 대한 참조가있는 세포 인구의 동작을 관찰하는 능력은 세포 생물학의 중요한 사전이다. 같은 mitotic와 같은 일반적인 절차는 세포주기 4-6의 특정 단계에서 세포를 분리하는 데 사용됩니다, 차등 원심 분리 또는 흐름 cytometry 기반 정렬을 뿌리 치다. 이러한 fractionated, 세포주기의 위상 강화 인구 그런 다음 실험적인 치료를 받게됩니다. 분리된 분수의 항복 순도 및 생존 능력은 종종 이러한 물리적인 분리 방법을 사용 위험 할 수 있습니다. 뿐만 아니라, 세포 인구의 분리 및 fractionated 세포가 선택한 셀 사이클 단계에서 발전할 수 의하여 실험적 치료의 시작 사이의 시간 경과는 성공적인 구현과 실험의 해석에 상당한 어려움을 초래할 수 있습니다.
성 이밖에 접근udy 세포주기 단계는 세포를 동기화하는 화학 물질의 사용을 포함합니다. 각각의 세포주기의 단계에 대한 주요 신진 대사 과정의 화학 억제제와 세포 치료는 다음 단계로 세포주기의 진행을 차단에 유용합니다. 예를 들어,하여 G1 / S 시점에서 ribonucleotide 환원 효소 억제제 hydroxyurea 중단 전지 deoxynucleotides, DNA의 빌딩 블록의 공급을 제한. 다른 주목할만한 화학 물질이 aphidicolin과 치료를 포함, mitotic 스핀들 형성에 방해가 둘 다 G1 연금을위한 중합 효소 알파 억제제, 콜히친 그리고 nocodazole과 치료, M 단계에서 세포를 중단하고 마지막으로, DNA 사슬 종결 5 fluorodeoxyridine과 치료 시작 S 위상 체포 7-9. 이러한 화학 물질로 치료는 특정 단계에서 세포의 전체 인구를 동기화의 효과적인 수단입니다. 화학 물질의 제거를 통해 세포 한마음으로 세포주기를 다시 가입. 테스트 에이전트 다음 릴리스의 치료세포주기를 차단하는 화학 물질로부터 elicited 마약 응답 유니폼, 세포주기 단계 – 특정 인구에서임을 보장합니다. 그러나, 화학 synchronizers의 많은 이래 도전하고 다양한 반응 경로 (테스트 에이전트 대 synchronizers까지)의 참여를 차별 괴롭히고, genotoxic 화합물을 알려져 있습니다.
여기에서 우리는 분열과 딸 세포의 분리에 이르기까지, DNA 복제 단계에서 자신의 진행을 통해 적극적으로 사이클링 세포의 subpopulation에 따라위한 신진 대사 라벨링 방법을 설명합니다. 유동세포계측법의 부량 결합이 프로토콜의 부재에서 세포주기의 운동 진행 중 측정 가능 중 기계적 또는 화학적으로 유도된 세포는 일반적으로 다른 세포주기의 동기화 방법 10와 관련된 강조합니다. 다음 섹션에서 우리는뿐만 아니라 생명 의학 연구 애플 리케이션의 일부로서, 방법론을 설명합니다.
Protocol
Discussion
BrdU의 설립과 함께 유동세포계측법를 결합함으로써, 우리는 세포주기의 속도론을 연구하는 데 필요한 도구를 가지고. thymidine의 아날로그로 작동하려면 BrdU의 독특한 속성은 자전거 세포의 DNA 컨텐츠 부량을 허용거야. 세포주기의 합성 단계에서 성장하는 딸의 DNA 가닥으로 BrdU의 법인이 하나가 G2에서 성장의 시대에 궁극적으로 세포 분열로, S 단계에서 DNA의 복제를 통해 자전거 세포의 subpopulation?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 FACS 분석과 도움을 UBC의 바이오 메디컬 연구 센터의 앤디 존슨 감사드립니다. 왕 연구소에서 암 연구 기금은 캐나다 암 협회 연구소 (운영 기금 # 019250)와 약학, UBC 학부의 연구 재투자 자금에서 제공됩니다. JMYW는 캐나다 연구 의자 및 건강 연구 경력 개발 프로그램에 대한 마이클 스미스 재단이 지원됩니다.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
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