Måling cellesyklusprogresjon Kinetics med metabolsk Merking og flowcytometrisystemer
Summary
Sporing subtile endringer i progresjon og kinetikk av cellesyklus stadier kan oppnås ved bruk av en kombinasjon av metabolsk merking av nukleinsyrer med BrdU og total genomisk DNA farging via propidium jodid. Denne metoden unngår behovet for kjemisk synkronisering av sykling celler, og dermed hindre innføring av ikke-spesifikk DNA-skade, som igjen påvirker cellesyklus progresjon.
Abstract
Nøyaktig kontroll av initiering og påfølgende progresjon gjennom de ulike fasene av cellesyklus er av avgjørende betydning i voksende celler. Cellesyklus divisjon er en integrert del av vekst og reproduksjon og deregulering av sentrale cellesyklus komponenter har vært innblandet i de utløsende hendelsene i kreftutvikling 1,2. Molekylære agenter i anti-kreft terapier ofte målrette biologiske mekanismer er ansvarlige for regulering og koordinering av cellesyklus divisjon tre. Selv cellesyklus kinetikk tendens til å variere i henhold til celletype, er fordelingen av celler blant de fire fasene av cellesyklus heller konsekvent innenfor en bestemt cellelinje grunn konsistent mønster av mitogen og vekstfaktor uttrykk. Gentoksiske hendelser og andre cellulære stressfaktorer kan resultere i en midlertidig blokk med cellesyklusprogresjon, noe som resulterer i arrest eller en midlertidig pause i en bestemt celle syklus fase for å tillate instinavigasjonsknappene av riktig svar mekanisme.
Muligheten til å eksperimentelt observere atferden til en celle befolkning med referanse til deres cellesyklusprogresjon stadium er et viktig fremskritt i cellebiologi. Vanlige prosedyrer som mitotisk riste av, differensial sentrifugering eller flowcytometri-baserte sortering brukes til å isolere cellene på bestemte faser av cellesyklus 4-6. Disse Oppdelte, cellesyklus fase-beriket populasjoner blir deretter utsatt for eksperimentell behandling. Yield, renhet og levedyktighet av de utskilte fraksjoner kan ofte bli kompromittert ved hjelp av disse fysiske separasjonsmetoder. I tillegg kan tidsforløp mellom separasjon av celle populasjoner og i starten av eksperimentell behandling, der de fraksjonert cellene kan utvikle seg fra den valgte cellen syklus scenen, stiller betydelige utfordringer i en vellykket gjennomføring og tolkning av disse eksperimentene.
Andre tilnærminger til study cellesyklus stadier inkluderer bruk av kjemikalier for å synkronisere celler. Behandling av celler med kjemiske inhibitorer av sentrale metabolske prosesser for hver celle syklus stadium er nyttige i blokkerer progresjon av cellesyklus til neste stadium. For eksempel, de ribonukleotidreduktase hemmer hydroksyurea stopper cellene ved G1 / S tidspunkt ved å begrense tilførselen av deoxynucleotides, byggesteinene i DNA. Andre kjente kjemikalier omfatter behandling med aphidicolin, til en polymerase alfa-hemmer for G1 arrest, behandling med kolkisin og nocodazole, som begge forstyrre mitotisk spindel formasjon stanse celler i M fase og til slutt, til behandling med DNA-kjeden terminator 5-fluorodeoxyridine initiere S fase arrest 7-9. Behandling med disse kjemikaliene er et effektivt middel for å synkronisere en hel populasjon av celler på et bestemt fase. Med fjerning av kjemiske, celler gjenoppta cellesyklus i kor. Behandling av testen agenten følgende utgivelsefra cellen syklus blokkerer kjemisk sikrer at stoffet responsen utløses er fra en uniform, cellesyklus scene-spesifikk befolkningen. Men siden mange av de kjemiske synchronizers kjent gentoksiske stoffer, erting hverandre deltakelse av ulike respons pathways (til synchronizers vs test agentene) er utfordrende.
Her beskriver vi en metabolsk merking metode for å følge en undergruppe aktivt sykling celler gjennom sin progresjon fra DNA replikasjon fasen, gjennom til deling og utskillelse av deres datter celler. Sammen med flowcytometri kvantifisering, gjør denne protokoll for måling av kinetisk progresjon av cellesyklus i fravær av enten mekanisk eller kjemisk indusert mobilnettet understreker ofte assosiert med andre cellesyklus synkronisering metoder 10. I de følgende avsnittene vil vi diskutere metodikk, samt noen av sine applikasjoner i biomedisinsk forskning.
Protocol
Discussion
Ved å kombinere flowcytometri med BrdU innlemmelse, har vi de nødvendige verktøy for å studere cellesyklus kinetikk. Den karakteristiske egenskap BrdU å fungere som en tymidin analogt er det som gjør at for DNA innhold kvantifisering av en sykkel celle. Inkorporering av BrdU i et voksende datter DNA-tråden under syntese fasen av cellesyklus er det som gjør en til å følge en undergruppe sykling cellene gjennom replikasjon av DNA i S-fasen, til en periode med vekst på G2 og til slutt til celledeling . Datter Br…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andy Johnson av Biomedical Research Center på UBC for hjelp med FACS analyse. Cancer Research Funding i Wong Laboratory er levert av Canadian Cancer Society Research Institute (driftstilskudd # 019250) og fra forskning reinvesteringer midler ved Fakultet for Pharmaceutical Sciences, UBC. JMYW støttes av Canada Research Stoler og Michael Smith Foundation for Health Research Career utviklingsprogrammer.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
