Célula de medida Cinética la progresión del ciclo con el etiquetado metabólico y Citometría de Flujo
Summary
Rastreo cambios sutiles en la progresión y la cinética de las fases del ciclo celular puede llevarse a cabo mediante el uso de una combinación de marcaje metabólico de los ácidos nucleicos con BrdU y tinción de ADN genómico total a través de yoduro de propidio. Este método evita la necesidad de sincronización química de ciclo de las células, impidiendo así la introducción de daño en el DNA no específico, que a su vez afecta a la progresión del ciclo celular.
Abstract
El control preciso de la iniciación y progresión posterior a través de las distintas fases del ciclo celular son de importancia primordial en la proliferación de las células. La división celular ciclo es una parte integral del crecimiento y la reproducción y la desregulación de los principales componentes del ciclo celular han sido implicados en los eventos precipitantes de 1,2 carcinogénesis. Agentes moleculares en terapias contra el cáncer con frecuencia buscan vías biológicas responsables de la regulación y la coordinación de la división del ciclo celular 3. Aunque la cinética del ciclo celular tienden a variar según el tipo de célula, la distribución de las células entre las cuatro fases del ciclo celular es bastante consistente dentro de una línea celular particular debido al patrón consistente de mitógeno y la expresión del factor de crecimiento. Eventos genotóxicos y otros factores de estrés celular puede resultar en un bloqueo temporal de la progresión del ciclo celular, lo que resulta en la detención o una pausa temporal en una fase del ciclo celular particular para permitir a las institucionesgación del mecanismo de respuesta adecuada.
La capacidad de observar experimentalmente el comportamiento de una población de células con referencia a su etapa progresión del ciclo celular es un avance importante en la biología celular. Los procedimientos comunes, tales como mitótico quitarse de encima, centrifugación diferencial o de la clasificación de citometría de flujo basada en se utilizan para aislar las células en determinadas fases del ciclo celular 4-6. Estos fraccionados, del ciclo celular enriquecidos fase-poblaciones son luego sometidos a tratamientos experimentales. Rendimiento, la pureza y la viabilidad de las fracciones separadas a menudo puede ser comprometida utilizando estos métodos de separación físicos. A su vez, el lapso de tiempo entre la separación de las poblaciones de células y el inicio de un tratamiento experimental, mediante el cual las células fraccionadas puede pasar de la fase del ciclo celular seleccionado, pueden presentar retos significativos en la implementación exitosa y la interpretación de estos experimentos.
Otros enfoques para stUdy etapas del ciclo celular incluyen el uso de productos químicos para sincronizar las células. El tratamiento de células con inhibidores químicos de los principales procesos metabólicos para cada fase del ciclo celular son útiles para bloquear la progresión del ciclo celular a la siguiente etapa. Por ejemplo, el ribonucleótido reductasa hidroxiurea detiene las células en la coyuntura G1 / S mediante la limitación de la oferta de desoxinucleótidos, los bloques básicos del ADN. Otros productos químicos notables incluyen el tratamiento con afidicolina, un inhibidor de la alfa polimerasa para la detención G1, el tratamiento con colchicina y nocodazole, ambos de los cuales interfieren con la formación de huso mitótico para detener las células en fase M y finalmente, el tratamiento con el ADN terminador de la cadena 5-fluorodeoxyridine iniciar a S fase de la detención 7.9. El tratamiento con estos productos químicos es un medio eficaz para sincronizar una población total de células en una fase particular. Con la eliminación de la sustancia química, las células de reunirse con el ciclo celular al unísono. El tratamiento de la versión de prueba siguiente agentea partir de la química del ciclo celular de bloqueo asegura que la respuesta al fármaco provocó es de un uniforme, ciclo celular etapa específica de la población. Sin embargo, dado que muchos de los sincronizadores químicos son compuestos conocidos genotóxicos, separando la participación de diversas vías de respuesta a los sincronizadores (frente a los agentes de prueba) es un reto.
Aquí se describe un método de marcaje metabólico para el seguimiento de una subpoblación de células activamente bicicleta a través de su progresión desde la fase de replicación del ADN, a través de la división y la separación de sus células hijas. Junto con la cuantificación de citometría de flujo, este protocolo permite la medición de la progresión cinética del ciclo celular en ausencia de ya sea mecánicamente o químicamente inducida celular subraya comúnmente asociada con otras metodologías de células de sincronización del ciclo 10. En las siguientes secciones vamos a discutir la metodología, así como algunas de sus aplicaciones en la investigación biomédica.
Protocol
Discussion
Mediante la combinación de la citometría de flujo con la incorporación de BrdU, tenemos las herramientas necesarias para estudiar la cinética del ciclo celular. La característica distintiva de BrdU para funcionar como un análogo de la timidina es lo que permite la cuantificación de ADN contenido de una celda de ciclismo. La incorporación de BrdU en una hebra de ADN hija creciente durante la fase de síntesis del ciclo celular es lo que permite seguir una subpoblación de células de ciclismo a través de la repl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Andy Johnson, del Centro de Investigación Biomédica de la UBC para la asistencia con el análisis de FACS. Financiación de Investigación del Cáncer en el Laboratorio de Wong es proporcionada por la Sociedad Canadiense del Cáncer del Instituto de Investigación (subvención de funcionamiento # 019250) y de Reinversión de los fondos de investigación de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de la UBC. JMYW con el apoyo de las Cátedras de investigación de Canadá y la Michael Smith Foundation para los programas de Investigación en Salud de desarrollo profesional.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| bromodeoxyuridine | Becton Dickinson | 55089 | |
| propidium iodide | Sigma | 287075 | 1mg/ml stock |
| FITC anti-BrdU | Becton Dickinson | 347583 | |
| sodium tetraborate | Fisher | S80172 | 0.1M, pH 8.5 |
| FACS Caliber | Becton Dickinson |
References
- Musgrove, E. A., Caldon, C. E., Barraclough, J., Stone, A., Sutherland, R. L. Cyclin D as a therapeutic target in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11, 558-572 (2011).
- Molchadsky, A., Rivlin, N., Brosh, R., Rotter, V., Sarig, R. p53 is balancing development, differentiation and de-differentiation to assure cancer prevention. Carcinogenesis. 31, 1501-1508 (2010).
- Dickson, M. A., Schwartz, G. K. Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy. Curr. Oncol. 16, 36-43 (2009).
- Banfalvi, G. Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation. Nat. Protoc. 3, 663-673 (2008).
- van Opstal, A., Boonstra, J. Inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase activity prevent cell cycle progression and induce apoptosis at the M/G1 transition in CHO cells. Cell Mol. Life Sci. 63, 220-228 (2006).
- Gasnereau, I. Flow cytometry to sort mammalian cells in cytokinesis. Cytometry. A. 71, 1-7 (2007).
- Harper, J. V. Synchronization of cell populations in G1/S and G2/M phases of the cell cycle. Methods Mol. Biol. 296, 157-166 (2005).
- Pedrali-Noy, G. Synchronization of HeLa cell cultures by inhibition of DNA polymerase alpha with aphidicolin. Nucleic Acids Res. 8, 377-387 (1980).
- Merrill, G. F. Cell synchronization. Methods Cell Biol. 57, 229-249 (1998).
- Fleisig, H. B., Wong, J. M. Telomerase promotes efficient cell cycle kinetics and confers growth advantage to telomerase-negative transformed human cells. Oncogene. , (2011).
- Cai, D., Byth, K. F., Shapiro, G. I. AZ703, an imidazo[1,2-a]pyridine inhibitor of cyclin-dependent kinases 1 and 2, induces E2F-1-dependent apoptosis enhanced by depletion of cyclin-dependent kinase 9. Cancer Res. 66, 435-444 (2006).
- Pozarowski, P., Darzynkiewicz, Z. Analysis of cell cycle by flow cytometry. Methods Mol. Biol. 281, 301-311 (2004).
- Sherwood, S. W., Rush, D. F., Kung, A. L., Schimke, R. T. Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry. Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).
