Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie
Summary
Wij meten de spanning release in een axon die gedeeltelijk was gelaedeerde met een laser dissector door gelijktijdige krachtspectroscopie meting uitgevoerd op een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. De ontwikkelde experimentele protocol evalueert de axon hechting aan de cultuur substraat.
Abstract
De vorming van functionele verbindingen in een ontwikkelende neurale netwerk wordt beïnvloed door extrinsieke signalen. De neuriet groei van ontwikkelingslanden neuronen de chemische en mechanische signalen, en de mechanismen die het detecteert en aan mechanische signalen worden slecht begrepen. Ophelderen van de rol van krachten in maturatiemerkers zal de inrichting van steigers die celadhesie en cytoskelet koppeling kunnen bevorderen het substraat en daarom de capaciteit van verschillende neuronale types te regenereren na letsel.
Hier beschrijven we een methode om simultane kracht spectroscopie metingen gelden tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. Wij meten spanningsversie in de gedeeltelijk laesie axon door gelijktijdige interferometrische volgen van een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. Onze experimentele protocol detecteert de spanning release met piconewton gevoeligheid, en de dynamiek van de spanning vrijkomen tenmilliseconde tijdsresolutie. Daarom biedt een hoge-resolutie methode te onderzoeken hoe de mechanische koppeling tussen cellen en substraten gemoduleerd door farmacologische behandeling en / of verschillende mechanische eigenschappen van het substraat kan zijn.
Introduction
Optische microscopie is een van de minder invasieve beeldvormingssysteem beschikbare levende cellen nemen. Bij de exploitatie van effecten zoals straling druk (zoals in optisch pincet 1) of hoge foton flux (zoals in laser dissector 2), werd deze technologie uitgebreid naar nano-manipulatie. De optische imaging-systeem levert een nauwkeurige controle te visualiseren en manipuleren sub cellulaire doelwitten 3. Tegelijkertijd, dankzij de nauwkeurige kalibratie van de geleverde laservermogen optisch gereedschap bereiken of zachte invasieve monster manipulatie met ongekende reproduceerbaarheid.
Verschillende laboratoria geïntegreerd in dezelfde experimentele opstelling, optisch pincet en laser dissector om organellen 4 te versmelten 5 verschillende cellen, of cellen te stimuleren door optisch aangedreven ladingen 6,7 ablatie. Terwijl optische pincetten, na ijking van de optische stijfheid, zorgen voorde controle van de toegepaste kracht naar de cel op een piconewton schaal, kan laser dissectie systemen optische manipulatie, die varieert van membraan foto-incorporatie aan ablatie van enkele organellen of dissectie van sub-cellulaire structuren moduleren. Echter, laser dissectie kalibratie gebaseerd op kwalitatieve beoordeling van het geheel van optische manipulatie ten aanzien van de energie geleverd aan het monster, voornamelijk gebaseerd op het inzicht geeft morfologische veranderingen veroorzaakt aan het monster 8. In de gepresenteerde methode, laten we zien hoe de kracht spectroscopie metingen uit te voeren tijdens de laser axonale dissectie van een zich ontwikkelende neuron, te kwantificeren, op piconewton schaal, de kracht geproduceerd door een veranderde evenwicht in het cytoskelet structuur van een sub-cellulair compartiment 9. Gekweekte neuronen aan het substraat hechten en polariseren tijdens de ontwikkeling. De polarisatie fase optreedt gedurende de eerste vijf dagen in vitro. In fase twee van polarisatie, een van de extrudersing neurieten langer wordt, en het zal differentiëren tot het axon 10 geworden. Axonale rek in reactie op de trekkracht naar de groei kegel is eerder gemodelleerd door Dennerl's model 11. Onlangs heeft dit model uitgebreid 12 om de rol van neurieten hechting aan de extracellulaire matrix substraten omvatten. Deze biofysische model, na experimentele waarnemingen 13 voorgesteld, bleek dat trekkrachten op groeikegel, propageren langs de neuriet, gemoduleerd wordt door focale adhesies aan het substraat. Evenzo, axonale laesie produceert een lokale versie van spanning uitdragen naar de cel lichaam. Zo hebben we voorgesteld dat het meten van dergelijke uitgebracht spanning in een locatie langs de axon tussen de laesie en de cel soma biedt de mogelijkheid om de demping resultaat van onaangetast focale adhesies beoordelen.
We kalibreren noodzakelijke foton-flux van de laser dissector de omvang van het aangedane axonale damag beheersene, van volledige doorsnijding tot gedeeltelijke laesie. Na de kalibratie, herhaalden we gedeeltelijke laesie axons van meerdere neuronen differentiëren en ontwikkelde protocol de spanningspennen kwantificeren, en aldus een kwantitatieve parameter voor de hechting van de axon schatten dat het substraat 14 verkregen.
In dit werk hebben we in detail de ontwikkelde protocol, dat een nauwkeurige experimentele procedure te evalueren en te vergelijken met de gevoeligheid piconewton axonale hechting aan het substraat in verschillende experimentele condities, zoals chemische 14, of verschillende soorten celkweek support vertegenwoordigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij rapporteren in dit werk een kwantitatieve methode om de neuriet hechting te vergelijken met de cultuur substraat, door het uitvoeren van gelijktijdige kracht spectroscopie meting tijdens laser-geïnduceerde cel laesie. De gemeten afgifte van spanning gerelateerd aan de mate van hechting van de cellen aan het substraat: cellen met een hoger aantal focale adhesies zou minder spanning los. Het meten van de release van spanning in termen van picoNewtons biedt een fysieke hoeveelheid waarmee de axonale hechting in versch…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani voor het ontwikkelen van de real-time besturingssysteem, Evelina Chieregatti en Hanako Tsushima voor inzichtelijke discussies, Giacomo Pruzzo en Alessandro Parodi voor de ontwikkeling van aangepaste elektronica en software, en Claudia Chiabrera en Marina Nanni voor hun deskundig advies en bijstand in celcultuur voorbereiding.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
