ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定
Summary
我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。
Abstract
現像神経回路網内の機能的な結合の形成は、外因性の合図によって影響される。開発ニューロンの神経突起成長は化学的および機械的信号、および機械的な信号に、それは感覚や反応があまり理解されているのメカニズムに従うものとします。細胞成熟の力の役割を解明することは、基板に細胞接着および細胞骨格の結合を促進し、従って損傷後の神経再生するために、異なるタイプの能力を向上させることができる足場の設計を可能にする。
ここでは、レーザ誘起細胞の病変中に同時力分光測定を適用する方法について述べる。私たちは、軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブの同時干渉追跡によって部分的に病変軸索に張力放出を測定。我々の実験的なプロトコルは、ピコニュートン感度の張力解放を検出し、テンションリリースの動的にミリ秒の時間分解能。従って、細胞と基質との間の機械的結合が薬物治療及び/又は基板の別個の機械的特性により変調することができる方法を研究するための高解像度の方法を提供する。
Introduction
光学顕微鏡は、生きた細胞を観察するために使用できる、低侵襲イメージング·システムの一つである。そのような放射圧（光ピンセット1のように）、または高エネルギー光子束（レーザディセクタ2のように）として作用の利用では、この技術は、ナノ操作まで延長された。光学撮像システムは、3つのサブ細胞標的を視覚化して操作するための正確な制御を供給する。同時に、送達レーザパワーの正確な較正のおかげで、光ツールは前例のない再現性のいずれかまたはソフト侵襲試料操作を実現する。
いくつかの研究室は、異なるセル5が互いに融合したり、光学的に貨物6,7を駆動することにより細胞を刺激し、細胞小器官4を焼灼するために、同じ実験設定、光ピンセット、レーザディセクタに、統合された。光ピンセットは、光学剛性のキャリブレーションした後、可能にする一方でピコニュートンスケールのセルに印加される力の制御は、レーザ切開システムは、膜の光ポレーションからサブ細胞構造の単一細胞小器官又は解剖の切除の範囲光学的操作を調節することができる。しかし、レーザー解剖校正は、主に試料8に生じた形態学的変化を示す画像分析に基づいてサンプルに送達されるエネルギー、光に対する操作のエンティティの定性的評価に依存している。提示手法では、ピコニュートンスケール、サブ細胞区画9の細胞骨格構造の変化した平衡によって生成力に、定量化するために、開発ニューロンのレーザー軸索の解剖時に力の分光測定を実行する方法を示します。培養されたニューロンは、基板に付着し、開発中に分極する。偏光位相は、in vitroで最初の5日の間に発生します。偏光の第二段階では、EXTRUDの一つるの突起が長くなり、それが軸索10になるように分化する。成長円錐での牽引力に応じて、軸索の伸びが以前Dennerlのモデル11でモデル化されています。最近では、このモデルは、細胞外マトリックスの基材への密着性神経突起の役割を含むように12を拡張されている。実験観察13後提案この生物物理学的モデルは、神経突起に沿って伝搬する、成長円錐に力を引っ張ったことを示した、基材への接着斑によって変調される。同様に、軸索の病変は、細胞体に向かって伝播する緊張の局所放出を生成します。従って、我々は病変と細胞相馬間軸索に沿った位置でこのような解放の張力を測定することは影響を受けない接着斑の減衰成果を評価するための可能性を提供することを提案。
私たちは、招いた軸索damagの程度を制御するために必要なエネルギーレーザーディセクタのフォトンフラックスを校正電子、完全離断からの部分的な病変へ。キャリブレーションに続いて、我々はいくつかの差別化ニューロンの軸索への部分的な病変を繰り返すとテンション放出を定量化するためのプロトコルを開発し、これにより基板14に軸索の密着性を推定するための定量的なパラメータを取得しました。
本研究では、詳細にはそのような化学的処理14、または細胞培養担体異なるタイプのような異なる実験条件では、基板への軸索の密着性を評価し、ピコニュートンの感度と比較する正確な実験手順を表す開発されたプロトコルを記述する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、この研究でレーザー誘起細胞の病変中に同時力分光測定を行うことにより、培養基板への密着性神経突起を比較する定量的な方法を報告する。緊張の測定されたリリースは、基板への細胞の付着の度合いに関係している：接着斑数の多い細胞が少なく緊張を解放する必要があります。ピコニュートンの面で緊張の放出を測定することは、異なる実験条件14で培養支持体に軸索…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
細胞培養の準備での専門家の助言と支援のためのカスタム電子機器やソフトウェアの開発のための洞察に満ちた議論を、ジャコモPruzzoとアレッサンドロパロディのためのリアルタイム制御システム、エヴェリーナChieregattiと花子対馬を開発するためのアルベルトGuiggiani、とクラウディアキアブレーラとマリーナナンニ。
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
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