Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l'adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution
Summary
Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.
Abstract
La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L'élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l'adhérence cellulaire et l'accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d'améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure.
Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l'axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d'une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l'axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.
Introduction
La microscopie optique est l'un du système de formation d'image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l'exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques 1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser 2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d'imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous 3. Dans le même temps, grâce à l'étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l'échantillon mou ou invasive avec une reproductibilité sans précédent.
Plusieurs laboratoires intégrés, dans le même dispositif expérimental, pinces optiques et dissecteur laser afin de réaliser l'ablation organites 4, à fusionner les différentes cellules 5, ou pour stimuler les cellules par entraîné optiquement cargaisons 6,7. Bien pinces optiques, après étalonnage de la rigidité optique, permettent dele contrôle de la force appliquée à la cellule sur une échelle piconewton, les systèmes de dissection laser peut moduler la manipulation optique, qui va de la membrane photo-ration à l'ablation des organites simples ou dissection des structures sub-cellulaires. Cependant, l'étalonnage de dissection laser repose sur l'évaluation qualitative de l'entité de manipulation optique par rapport à l'énergie fournie à l'échantillon, principalement basée sur l'analyse d'images illustrant les changements morphologiques dus à l'échantillon 8. Dans la méthode présentée, nous montrons comment effectuer la mesure de la spectroscopie de force au cours de la dissection axonale laser d'un neurone en développement, pour quantifier, sur l'échelle piconewton, la force produite par un équilibre altération de la structure du cytosquelette d'un compartiment subcellulaire 9. Des neurones en culture adhèrent au substrat, et polarisent au cours du développement. La phase de polarisation se produit durant les cinq premiers jours in vitro. À la deuxième étape de la polarisation, l'un des Extrudment neurites est long, et il faudra différencier pour devenir l'axone 10. Élongation des axones en réponse à la force de traction au niveau du cône de croissance a déjà été modélisé par le modèle de Dennerl 11. Récemment, ce modèle a été étendu pour inclure 12 le rôle de l'adhésion neurites sur les substrats de la matrice extracellulaire. Ce modèle biophysique, proposé après les observations expérimentales 13, a montré que les forces de traction sur le cône de croissance, se propageant le long de la neurites, sont modulés par des adhérences focales au substrat. De même, lésion axonale produit une libération locale de tension se propageant en direction du corps de la cellule. Ainsi, nous avons proposé que la mesure de cette tension libérée dans un emplacement le long de l'axone entre la lésion et le corps cellulaire offre la possibilité d'évaluer l'issue d'amortissement des adhésions focales ne sont pas touchés.
Nous calibrer l'énergie nécessaire photons flux de la dissection laser pour contrôler l'étendue de l'avarie de axonale infligéee, de la section complète de la lésion partielle. Après la calibration, nous avons répété lésion partielle des axones des neurones plusieurs différenciation et développé le protocole de quantifier le relâchement de la tension, et obtient ainsi un paramètre quantitatif pour estimer l'adhérence de l'axone au substrat 14.
Dans le présent travail, nous décrivons en détail le protocole mis au point, ce qui représente une procédure expérimentale précise pour évaluer et comparer avec sensibilité piconewton l'adhésion axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales telles que le traitement chimique 14, ou différents types de support de culture cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l'adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d'adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d'adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité phy…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani pour développer le système de contrôle en temps réel, Evelina Chieregatti et Hanako Tsushima des discussions perspicaces, Giacomo Pruzzo et Alessandro Parodi pour le développement de l'électronique et des logiciels personnalisés et Claudia Chiabrera et Marina Nanni pour leurs conseils d'expert et aide à la préparation de culture cellulaire.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et al. Surgery with molecular fluorescence imaging using activatable cell-penetrating peptides decreases residual cancer and improves survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4317-4322 (2010).
- Stiess, M., Maghelli, N., et al. Axon extension occurs independently of centrosomal microtubule nucleation. Science. 327, 704-707 (2010).
- Steubing, R. W., Cheng, S., Wright, W. H., Numajiri, Y., Berns, M. W. Laser induced cell fusion in combination with optical tweezers: the laser cell fusion trap. Cytometry. 12, 505-510 (1991).
- Pinato, G., Raffaelli, T., D’Este, E., Tavano, F., Cojoc, D. Optical delivery of liposome encapsulated chemical stimuli to neuronal cells. J. Biomed. Opt. 16, 095001-095004 (2011).
- Kress, H., Park, J. G., et al. Cell stimulation with optically manipulated microsources. Nat. Methods. 6, 905-909 (2009).
- Berns, M. W. A history of laser scissors (microbeams). Methods Cell Biol. 82, 1-58 (2007).
- Difato, F., Dal, M. M., et al. Combined optical tweezers and laser dissector for controlled ablation of functional connections in neural networks. Journal of Biomedical Optics. 16, 051306_1-051306_8 (2011).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Cell Biol. 108, 1507-1516 (1989).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J. Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- O’Toole, M., Miller, K. E. The role of stretching in slow axonal transport. Biophys. J. 100, 351-360 (2011).
- O’Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys. J. 94, 2610-2620 (2008).
- Difato, F., Tsushima, H., et al. The formation of actin waves during regeneration after axonal lesion is enhanced by BDNF. Nature Scientific Reports. 1 (183), (2011).
- Difato, F., Schibalsky, L., Benfenati, F., Blau, A. Integration of optical manipulation and electrophysiological tools to modulate and record activity in neural networks. International Journal of Optomechatronics. , 191-216 (2011).
- Guiggiani, A., Torre, B., et al. Long-range and long-term interferometric tracking by static and dynamic force-clamp optical tweezers. Opt. Express. 19, 22364-22376 (2011).
- Guiggiani, A., Basso, M., Vassalli, M., Difato, F. RealTime Suite: a step-by-step introduction to the world of real-time signal acquisition and conditioning. 3rd Real Time Linux Workshop. , (2011).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Review of Scientific Instruments. 75, 2787-2809 (2004).
- Togo, T., Krasieva, T. B., Steinhardt, R. A. A decrease in membrane tension precedes successful cell-membrane repair. Mol. Biol. Cell. 11, 4339-4346 (2000).
- Kress, H., Stelzer, E. H., et al. Filopodia act as phagocytic tentacles and pull with discrete steps and a load-dependent velocity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11633-11638 (2007).
- Togo, T. Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site. J. Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).
- Huang, H., Kamm, R. D., Lee, R. T. Cell mechanics and mechanotransduction: pathways, probes, and physiology. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C1-C11 (2004).
- Scrimgeour, J., Eriksson, E., Goksor, M. Laser surgery and optical trapping in a laser scanning microscope. Methods Cell Biol. 82, 629-646 (2007).
- Carter, A. R., King, G. M., et al. Stabilization of an optical microscope to 0.1 nm in three dimensions. Appl. Opt. 46, 421-427 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. The European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Roach, P., Parker, T., Gadegaard, N., Alexander, M. R. Surface strategies for control of neuronal cell adhesion: A review. Surface Science Reports. 65, 145-173 (2010).
